微生物數量測定——顯微鏡直接計數法

（一）目的要求

1．明確血細胞計數板計數的原理。

2．掌握使用血細胞計數板進(jìn)行微生物計數的方法。

（二） 基本原理

顯微鏡直接計數法是將小量待測樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上(又稱(chēng)計菌器)，于顯微鏡下直接計數的一種簡(jiǎn)便、快速、直觀(guān)的方法。目前國內外常用的計菌器有：血細胞計數板、Peteroff-Hauser計菌器以及Hawksley計菌器等，它們都可用于酵母、細菌、霉菌孢子等懸液的計數，基本原理相同。后兩種計菌器由于蓋上蓋玻片后，總容積為0.02mm³，而且蓋玻片和載波片之間的距離只有0.02mm，因此可用油浸物鏡對細菌等較小的細胞進(jìn)行觀(guān)察和計數。除了用這些計菌器外，還有在顯微鏡下直接觀(guān)察涂片面積與視野面積之比的估算法，此法一般用于牛乳的細菌學(xué)檢查。顯微鏡直接計數法的優(yōu)點(diǎn)是直觀(guān)、快速、操作簡(jiǎn)單。但此法的缺點(diǎn)是所測得的結果通常是死菌體和活菌體的總和。目前已有一些方法可以克服這一缺點(diǎn)，如結合活菌染色微室培養（短時(shí)間）以及加細胞分裂抑制劑等方法來(lái)達到只計數活菌體的目的。本實(shí)驗以血球計數板為例進(jìn)行顯微鏡直接計數。另外兩種計菌器的使用方法可參看各廠(chǎng)商的說(shuō)明書(shū)。

用血細胞計數板在顯微鏡下直接計數是一種常用的微生物計數方法。該計數板是一塊特制的載玻片，其上由四條槽構成三個(gè)平臺；中間較寬的平臺又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺上各列有一個(gè)方格網(wǎng)，每個(gè)方格網(wǎng)共分為九個(gè)大方格，中間的大方格即為計數室。計數室的刻度一般有兩種規格，一種是一個(gè)大方格分成25個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成16個(gè)小方格；另一種是一個(gè)大方格分成16個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成25個(gè)小方格，但無(wú)論是哪一種規格的計數板，每一個(gè)大方格中的小方格都是400個(gè)。每一個(gè)大方格邊長(cháng)為lmm，則每一個(gè)大方格的面積為lmm²，蓋上蓋玻片后，蓋玻片與載玻片之間的高度為0.lmm，所以計數室的容積為0.lmm³(萬(wàn)分之一毫升)

計數時(shí)，通常數五個(gè)中方格的總菌數，然后求得每個(gè)中方格的平均值，再乘上25或16，就得出一個(gè)大方格中的總菌數，然后再換算成lmL菌液中的總菌數。

設五個(gè)中方格中的總菌數為A，菌液稀釋倍數為B，如果是25個(gè)中方格的計數板，則

1mL菌液中的總菌數=A/5×25×104×B=50000A•B（個(gè)）

同理，如果是16個(gè)中方格的計數板，則

1mL菌液中的總菌數=A/5×16×104×B=32000A•B（個(gè)）

（三）器材

1．菌種  釀酒酵母

2．儀器或其他用具 血細胞計數板，顯微鏡，蓋玻片，無(wú)菌毛細滴管。

（四）操作步驟

l．菌懸液制備

以無(wú)菌生理鹽水將釀酒酵母制成濃度適當的菌懸液。

2．鏡檢計數室

在加樣前，先對計數板的計數室進(jìn)行鏡檢。若有污物，則需清洗，吹干后才能進(jìn)行計數。

3．加樣品

將清潔干燥的血細胞計數板蓋上蓋玻片，再用無(wú)菌的毛細滴管將搖勻的釀酒酵母菌懸液由蓋玻片邊緣滴一小滴，讓菌液沿縫隙靠毛細滲透作用自動(dòng)進(jìn)入計數室，一般計數室均能充滿(mǎn)菌液。

取樣時(shí)先要搖勻菌液；加樣時(shí)計數室不可有氣泡產(chǎn)生。

4．顯微鏡計數

加樣后靜止5min，然后將血細胞計數板置于顯微鏡載物臺上，先用低倍鏡找到計數室所在位置，然后換成高倍鏡進(jìn)行計數。

調節顯微鏡光線(xiàn)的強弱適當，對于用反光鏡采光的顯微鏡還要注意光線(xiàn)不要偏向一邊，否則視野中不易舌清楚計數室方格線(xiàn)，或只見(jiàn)豎線(xiàn)或只見(jiàn)橫線(xiàn)。

在計數前若發(fā)現菌液太濃或太稀，需重新調節稀釋度后再計數。一般樣品稀釋度要求每小格內約有5~10個(gè)菌體為宜。每個(gè)計數室選5個(gè)中格(可選4個(gè)角和中央的一個(gè)中格)中的菌體進(jìn)行計數。位于格線(xiàn)上的菌體一般只數上方和右邊線(xiàn)上的。如遇酵母出芽，芽體大小達到母細胞的一半時(shí)，即作為兩個(gè)菌體計數。計數一個(gè)樣品要從兩個(gè)計數室中計得的平均數值來(lái)計算樣品的含菌量。

5．清洗血細胞計數板

使用完畢后，將血細胞計數板在水龍頭用水沖洗干凈，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹風(fēng)機吹干。鏡檢，觀(guān)察每小格內是否有殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈，則必須重復洗滌至干凈為止。

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