實(shí)驗——微生物的分離與純化

實(shí)驗目的、要求

（1）學(xué)習并掌握細菌、放線(xiàn)菌、霉菌和酵母菌等四大類(lèi)微生物的稀釋分離、劃線(xiàn)分離等技術(shù)。

（2）學(xué)習從樣品中分離、純化出所需菌株。

（3）了解四大類(lèi)微生物的培養條件和培養時(shí)間。

       以細菌為例

實(shí)驗原理

純種分離技術(shù)是微生物學(xué)中重要的基本技術(shù)之一。分離：從混雜的微生物群體中獲得單一菌株純培養的方法。純種（純培養）：一株菌種或一個(gè)培養物中所有的細胞或孢子都是由一個(gè)細胞分裂、繁殖而產(chǎn)生的后代。

微生物的分離與純化技術(shù)的應用：分離具有特殊功能的微生物、優(yōu)良菌種及純化被污染的菌種等。

土壤是微生物的大本營(yíng)，混雜著(zhù)大量的微生物，從中分離可得到只含有這一種微生物的純培養。

稀釋分離法有傾注法和涂布法兩種；菌種被其他雜菌污染時(shí)或混合菌懸液常用劃線(xiàn)法進(jìn)行純種分離。

要獲得某種微生物的純培養，還需提供有利于該微生物生長(cháng)繁殖的最適培養基及培養條件。

微生物四大類(lèi)菌的分離培養基、培養溫度、培養時(shí)間詳見(jiàn)實(shí)驗指導書(shū)P67表格。細菌常用牛肉膏蛋白胨培養基，在30-37℃ 溫度下培養1-2天。

平板菌落計數——活菌計數

實(shí)驗儀器、材料

實(shí)驗材料    菌源:土樣10g;

培養基   牛肉膏蛋白胨培養基;

實(shí)驗儀器與用具

1)超凈工作臺、恒溫培養箱、酒精燈

2）1000ul及100ul移液槍、1000ul及100ul槍頭、無(wú)菌1.5ml的離心管、離心管架

3）無(wú)菌平皿、涂布棒、接種環(huán)

實(shí)驗試劑:無(wú)菌水;

實(shí)驗內容

1、采土樣:
   選擇肥沃土壤,去表層土,挖5－20cm深度的土壤數10g,裝入已滅菌的牛皮紙袋,封好袋口,帶回實(shí)驗室。

2、制備土壤稀釋液：

       稱(chēng)取土樣1.0g，放入盛99ml無(wú)菌水的三角瓶中，置搖床振蕩20min使土壤均勻分散成為土壤懸液（10-2）。用100ul移液槍從中吸取100ul土壤懸液，注入事先分裝有900ul無(wú)菌水的離心管中，吹吸3次，振蕩均勻（10-3）。然后同樣方法，配置成稀釋度為10-4，10-5的土壤菌懸液。

3、分離
1）涂布法

     用一支新的無(wú)菌槍頭，由低濃度開(kāi)始，從各濃度土壤稀釋液中各吸取100ul，對號較均勻地放入已寫(xiě)好稀釋度的牛肉蛋白胨培養基平板上，用灼燒冷卻后的無(wú)菌玻璃涂棒涂勻。每個(gè)濃度做3個(gè)平板（重復）。

2）傾注法

     用一支新的無(wú)菌槍頭，由低濃度開(kāi)始，從各濃度土壤稀釋液中各吸取100ul，對號較均勻地放入已寫(xiě)好稀釋度的空白無(wú)菌平皿中，然后在各平皿中加入已經(jīng)融化并冷卻到45 -50℃的牛肉膏蛋白胨培養基（已滅菌）12-15ml，將培養皿在超凈工作臺面上輕輕轉動(dòng)，使稀釋的菌懸液與融化的培養基混合均勻，直至培養基凝固。

注意：無(wú)菌操作；用槍頭吸取菌懸液時(shí)注意“吹打數次”確�；靹�。

4、培養

待平板上液體被完全吸收，將平板倒置于370C溫箱中培養24h；

5、菌落計數
含菌樣品的微生物經(jīng)稀釋分離培養后，每一個(gè)活菌細胞可在平板上繁殖形成一個(gè)肉眼可見(jiàn)的菌落，故可據平板上菌落的數目推算出每克含菌樣品中所含的活菌總數（菌落形成數目）。

每克含菌樣品中微生物的活細胞數（菌落形成數，CFU＝

（同一稀釋度平板上菌落平均數× 10×稀釋倍數）/含菌樣品克數

菌落計數規則：

選擇平均菌落數在30~300間的平板

（1）只有一個(gè)稀釋度符合，以該稀釋度的平均菌落數乘以稀釋倍數報告；

（2）有兩個(gè)稀釋度符合，取決于二者比值（高稀釋度的菌落數除以低稀釋度的菌落數的值）：

   a)若0.5≤比值≤2，以?xún)上♂尪鹊木�落數乘稀釋倍數所得的值的均值報告�?/FONT>