實(shí)驗：革蘭氏染色法

實(shí)驗目的 

1．學(xué)習并初步掌握革蘭氏染色法。 

2．了解革蘭氏染色法的原理及其在細菌分類(lèi)鑒定中的重要性。 

實(shí)驗內容 

1．制作細菌染色裝片。 

2．分別對單菌和混菌進(jìn)行革蘭氏染色法操作。 

實(shí)驗原理 

    用于生物染色的染料主要有堿性染料、 酸性染料和中性染料三大類(lèi)。 堿性染料的離子帶正電荷，能和帶負電荷的物質(zhì)結合。因細菌蛋白質(zhì)等電點(diǎn)較低，當它生長(cháng)于中性、堿性或弱酸性的溶液中時(shí)常帶負電荷，所以通常采用堿性染料（如美藍、結晶紫、堿性復紅或孔雀綠等）使其著(zhù)色。酸性染料的離子帶負電荷，能與帶正電荷的物質(zhì)結合。當細菌分解糖類(lèi)產(chǎn)酸使培養基 pH下降時(shí)，細菌所帶正電荷增加，因此易被伊紅、酸性復紅或剛果紅等酸性染料著(zhù)色。中性染料是前兩者的結合物又稱(chēng)復合染料，如伊紅美藍、伊紅天青等。 

    革蘭氏染色法是 1884年由丹麥病理學(xué)家 C.Gram所創(chuàng )立的。 革蘭氏染色法可將所有的細菌區分為革蘭氏陽(yáng)性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G—）兩大類(lèi)，是細菌學(xué)上最常用的鑒別染色法。 

    該染色法所以能將細菌分為 G+菌和 G—菌，是由這兩類(lèi)菌的細胞壁結構和成分的不同所決定的。G—菌的細胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類(lèi)脂質(zhì)，而且肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低，故用乙醇或丙酮脫色時(shí)溶解了類(lèi)脂質(zhì)，增加了細胞壁的通透性，使初染的結晶紫和碘的復合物易于滲出，結果細菌就被脫色， 再經(jīng)蕃紅復染后就成紅色。G+  菌細胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高， 類(lèi)脂質(zhì)含量少，經(jīng)脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，因此細菌仍保留初染時(shí)的顏色。 

實(shí)驗器材 

    培養 12-16h的枯草桿菌（Bacillus subtilis），培養 24 小時(shí)的大腸桿菌（Escherichia coli） 

    結晶紫、盧哥氏碘液、95%酒精、蕃紅、液體石蠟、擦鏡液 

    載玻片、接種杯、酒精燈、擦鏡紙、顯微鏡等。 

實(shí)驗步驟 

一、單菌的革蘭氏染色： 

    分別取枯草桿菌、大腸桿菌進(jìn)行革蘭氏染色。 

1．制片： 

(1) 涂菌：取干凈載玻片一塊，在載玻片上加一滴生理鹽水，按無(wú)菌操作法取菌涂片，注意取菌不要太多。 

(2) 干燥：讓涂片自然晾干或者在酒精燈火焰上方文火烘干。 

(3)固定：手執玻片一端，讓菌膜朝上，通過(guò)火焰 2-3次固定（以不燙手為宜）

2．染色 

(1) 初染：滴加結晶紫（以剛好將菌膜覆蓋為宜）染色 1～2min，水洗。 

(2) 媒染：用碘液沖去殘水，并用碘液覆蓋約 1min，水洗。 

(3) 脫色：用濾紙吸去玻片上的殘水，將玻片傾斜，在白色背景下，用滴管流加 95％的乙醇脫色，直至流出的乙醇無(wú)紫色時(shí)，立即水洗。 

(4) 復染：用番紅液復染約 2min，水洗。 

3．鏡檢：干燥后，用油鏡觀(guān)察。菌體被染成藍紫色的是革蘭氏陽(yáng)性菌，被染成紅色的為革蘭氏陰性菌。 

二、混菌的革蘭氏染色： 

    按上述方法，在同一載玻片上，以大腸桿菌和枯草芽孢桿菌作混和涂片、染色、鏡檢進(jìn)行比較。 

實(shí)驗結果及討論 

1．實(shí)驗結果 

    列表簡(jiǎn)述 2株細菌的染色觀(guān)察結果（說(shuō)明各菌的形狀、顏色和革蘭氏染色反應），分別繪制單菌及混菌的染色結果。 

2．討論 

    針對實(shí)驗原理、步驟、現象進(jìn)行討論。 

實(shí)驗作業(yè) 

1．你認為哪些環(huán)節會(huì )影響革蘭氏染色結果的正確性？其中最關(guān)鍵的環(huán)節是什么？ 

2．進(jìn)行革蘭氏染色時(shí)，為什么特別強調菌齡不能太老，用老齡細菌染色會(huì )出現什么問(wèn)題？ 

上一篇：實(shí)驗：細菌的鞭毛染色

下一篇：布氏桿菌的生物學(xué)性狀