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實(shí)驗目的
掌握細菌的鞭毛染色技術(shù)。
實(shí)驗內容
學(xué)習細菌的鞭毛染色法。
實(shí)驗原理
細菌的鞭毛極細，直徑一般為 10—20nm，只有用電子顯微鏡才能觀(guān)察到。但是，如采用特殊的染色法，則在普通光學(xué)顯微鏡下也能看到它。鞭毛染色方法很多，但其基本原理相同，即在染色前先用媒染劑處理，讓它沉積在鞭毛上，使鞭毛直徑加粗，然后再進(jìn)行染色。常用的媒染劑由丹寧酸和氯化高鐵或鉀明礬等配制而成�，F推薦以下兩種染色法。
實(shí)驗器材
培養 12-16h的水稻黃單胞菌（Xanthomonas oryzae），粘質(zhì)賽氏桿菌（Serratia marcescens）或假單細胞菌（Pseudomonas sp.）斜面菌種。
銀染色液、Leifson染色液、香柏油、二甲苯。
載玻片、擦鏡紙、吸水紙、記號筆、玻片擱架、鑷子、接種環(huán)，顯微鏡。
實(shí)驗步驟
1．鍍銀法染色
(1) 清洗玻片 選擇光滑無(wú)裂痕的玻片，最好選用新的。為了避免玻片相互重疊，應將玻片插在專(zhuān)用金屬架上， 然后將玻片置洗衣粉過(guò)濾液中 （洗衣粉煮沸后用濾紙過(guò)濾， 以除去粗顆粒）， 煮沸 20min。
取出稍冷后用自來(lái)水沖洗、晾干，再放入濃洗液中浸泡 5—6天，使用前取出玻片，用自來(lái)水沖去殘酸，再用蒸餾水洗。將水瀝干后，放入 95%乙醇中脫水。
(2) 菌液的制備及制片：菌齡較老的細菌容易失落鞭毛，所以在染色前應將待染細菌在新配制的牛肉膏蛋白胨培養基斜面上（培養基表面濕潤，斜面基部含有冷凝水）連續移接 3-5 代，以增強細菌的運動(dòng)力。最后一代菌種放恒溫箱中培養 12—16h。然后，用接種環(huán)挑取斜面與冷凝水交接處的菌液數環(huán)，移至盛有 1—2mL無(wú)菌水的試管中，使菌液呈輕度混濁。將該試管放在 37℃恒溫箱中靜置10min （放置時(shí)間不宜太長(cháng)，否則鞭毛會(huì )脫落），讓幼齡菌的鞭毛松展開(kāi)。然后，吸取少量菌液滴在潔凈玻片的一端，立即將玻片傾斜，使菌液緩慢地流向另一端，用吸水紙吸去多余的菌液。涂片放空氣中自然干燥。
用于鞭毛染色的菌體也可用半固體培養基培養。方法是將 0.3-0.4%的瓊脂肉膏培養基熔化后倒入無(wú)菌平皿中，待凝固后在平板中央點(diǎn)接活化了 3-4代的細菌，恒溫培養 12-16h后，取擴散菌落的邊緣制作涂片。
(3) 染色
① 滴加 A液，染 4—6min。
② 用蒸餾水充分洗凈 A液。
③ 用 B 液沖去殘水，再加 B 液于玻片上，在酒精燈火焰上加熱至冒氣，約維持 0.5—1min（加熱時(shí)應隨時(shí)補充蒸發(fā)掉的染料，不可使玻片出現干涸區）。
④ 用蒸餾水洗，自然干燥。
(4) 鏡檢：先低倍，再高倍，最后用油鏡檢查。
結果：菌體呈深褐色，鞭毛呈淺褐色。
2．改良 Leifson染色法
(1) 清洗玻片法同 1。
(2) 配制染料 染料配好后要過(guò)濾 15-20次后染色效果才好。
(3) 菌液的制備及涂片
① 菌液的制備同 1。
② 用記號筆在潔凈的玻片上劃分 3—4個(gè)相等的區域。
③ 放 1滴菌液于第一個(gè)小區的一端，將玻片傾斜，讓菌液流向另一端，并用濾紙吸去多余的菌液。
④ 干燥 在空氣中自然干燥。
(4) 染色
① 加染色液于第一區，使染料覆蓋涂片。隔數分鐘后再將染料加入第二區，依此類(lèi)推 （相隔時(shí)間可自行決定），其目的是確定最合適的染色時(shí)間，而且節約材料。
② 水洗：在沒(méi)有傾去染料的情況下，就用蒸餾水輕輕地沖去染料，否則會(huì )增加背景的沉淀。
③ 干燥：自然干燥。
(5) 鏡檢 先低倍觀(guān)察，再高倍觀(guān)察，最后再用油鏡觀(guān)察，觀(guān)察時(shí)要多找一些視野，不要企圖在 1-2個(gè)視野中就能看到細菌的鞭毛。
結果：菌體和鞭毛均染成紅色。
注意事項
1．鍍銀法染色比較容易掌握，但染色液必須每次現配現用，不能存放，比較麻煩。
2．Leifson染色法受菌種、菌齡和室溫等因素的影響，且染色液須經(jīng) 15-20次過(guò)濾，要掌握好染色條件必須經(jīng)過(guò)一些摸索。
3．細菌鞭毛極細，很易脫落，在整個(gè)操作過(guò)程中，必須仔細小心，以防鞭毛脫落。
4．染色用玻片干凈無(wú)油污是鞭毛染色成功的先決條件。
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