微生物對生物大分子的分解利用

實(shí)驗目的 

1．通過(guò)了解不同細菌對不同的生物大分子分解利用情況，從而認識微生物代謝類(lèi)型多樣性。 

2．進(jìn)一步學(xué)習平板接種法及穿刺接種法。 

實(shí)驗內容 

    學(xué)習微生物對生物大分子的分解利用能力的測定方法。 

實(shí)驗原理 

    微生物在生長(cháng)繁殖過(guò)程中，需從外界環(huán)境吸收營(yíng)養物質(zhì)。外界環(huán)境中的小分子有機物質(zhì)可被微生物直接吸收，而大分子有機物則不能被微生物直接吸收，它們須經(jīng)微生物分泌的胞外酶將其分解為小分子有機物，才能被吸收利用。例如生物大分于中的淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪等須經(jīng)微生物分泌的胞外酶，如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶分別分解為糖、肽、氨基酸、脂肪酸等之后，才能被微生物吸收而進(jìn)入細胞。 

    不同微生物分解利用生物大分子能力各有不同。只有那些能夠產(chǎn)生并分泌跑外酶的微生物才能利用大分子有機物。 

    現分別介紹淀粉水解、油脂水解、明膠液化和石蕊牛乳等試驗的簡(jiǎn)單原理。 

1．淀粉水解試驗 

    某些細菌能夠分泌淀粉酶（胞外酶），將淀粉水解為麥芽糖和葡萄糖，再被細菌吸收利用。淀粉被水解后遇碘不再變藍色。 

2．油脂水解試驗 

    某些細菌能夠分泌脂肪酶 （胞外酶），能將培養基中的脂肪水解為甘油和脂肪酸。所產(chǎn)生的脂肪酸，可通過(guò)預先加入油脂培養基中的中性紅加以指示[指示范圍 pH6.8（紅）～pH 8.0（黃）。當細菌分解脂肪產(chǎn)生脂肪酸時(shí)，培養基中出現紅色斑點(diǎn)。 

3．明膠液化試驗 

    明膠是一種動(dòng)物蛋白。明膠培養基本身在低于 20℃時(shí)凝固，高于 25℃則自行液化。某些細菌能夠產(chǎn)生蛋白酶（胞外酶），將明膠水解成小分子物質(zhì)，因此培養后的培養基即使在低于20℃的溫度下，明膠也不再凝固，而由原來(lái)的固體狀態(tài)變?yōu)橐后w狀態(tài)。 

4．石蕊牛乳試驗 

    牛乳中主要含有乳糖和酪蛋白。細菌對牛乳的利用主要是指對乳糖及酪蛋白的分解利用。牛乳中加入石蕊是作為酸堿指示劑和氧化還原指示劑。石蕊中性時(shí)呈淡紫色，酸性時(shí)呈粉紅色，堿性時(shí)呈藍色，還原時(shí)則部分或全部褪色變白。 

    細菌對牛乳的作用有以下幾種情況：

     （1）產(chǎn)酸  細菌發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，使石蕊變紅。 

     （2）產(chǎn)堿  細菌分解酪蛋白產(chǎn)生堿性物質(zhì)，使石蕊變藍。 

     （3）胨化  細菌產(chǎn)生蛋白酶，使酪蛋白分解，故牛乳變成清亮透明的液體。 

     （4）酸凝固  細菌發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，使石蕊變紅，當酸度很高時(shí)，可使牛乳凝固。 

     （5）凝乳酶凝固  細菌產(chǎn)生凝乳酶，使牛乳中酪蛋白凝固，此時(shí)石蕊呈藍色或不變色 

     （6）還原  細菌生長(cháng)旺盛時(shí)，使培養基氧化還原電位降低．因而石蕊被還原而褪色。 

實(shí)驗器材 

枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、粘乳產(chǎn)堿菌、銅綠假單胞菌。 

淀粉培養基、油脂培養基、明膠液化培養基、石蕊牛乳培養基。 

試管、三角瓶、培養皿、接種針、接種環(huán)等。 

碘液等。 

實(shí)驗步驟 

1．淀粉水解試驗 

(1) 將裝有淀粉培養基的錐形瓶置于沸水浴中融化，然后取出冷卻至 50℃左右，即傾入培養皿中，待凝固后制成平板。 

(2) 翻轉平板使底皿背面向上，用記號筆在其背面玻璃上劃成兩半，—半用于接種枯草芽孢桿菌作為陽(yáng)性對照菌，另一半用于接種試驗菌大腸桿菌或產(chǎn)氣腸桿菌。接種時(shí)用接種環(huán)取少量菌在平板兩邊各劃“十”字。 

(3) 將接完種的平板倒置于 37℃恒溫箱中，培養 24h。 

(4) 觀(guān)察結果時(shí)，可打開(kāi)皿蓋，滴加少量碘液于平板上，輕輕旋轉，使碘液均勻鋪滿(mǎn)整個(gè)平板。如菌體周?chē)�出現無(wú)色透明圈，則說(shuō)明淀粉已被水解。透明圈的大小，說(shuō)明該菌水解淀粉能力的強弱。 

2．油脂水解試驗 

(1) 將裝有油脂培養基的錐形瓶置于沸水浴中融化，取出并充分振蕩 （使油脂均勻分布），再傾入培養皿中，待凝固后制成平板。 

(2) 翻轉平板使底皿背面向上，用記號筆在其背面玻璃上劃成兩半。一半用于接種金黃色葡萄球菌作為陽(yáng)性對照菌，另一半用于接種實(shí)驗菌大腸桿菌或產(chǎn)氣腸桿菌。接種時(shí)用接種環(huán)取少量菌在平板兩邊各劃線(xiàn)接鐘。 

3) 將接種完的平板倒置于 37℃恒溫箱中，培養 24h。 

(4) 觀(guān)察結果時(shí)，注意觀(guān)察平板上長(cháng)菌的地方，如出現紅色斑點(diǎn)，即說(shuō)明脂肪已被水解，此為陽(yáng)性反應。 

3．明膠液化試驗 

(1) 用穿刺接種法分別接種大腸桿菌或產(chǎn)氣腸桿菌于明膠培養基中。 

(2) 接種后置于 20℃恒溫箱中，培養 48h。 

(3) 觀(guān)察結果時(shí)，注意培養基有無(wú)液化情況及液化后的形狀。 

4．石蕊牛乳試驗 

(1) 分別接種粘乳產(chǎn)堿菌或銅綠假單胞菌于二支石蕊牛乳培養基中，置于 37℃恒溫箱中培養 7d。另外保留一支不接種石蕊牛乳培養基作對照。 

(2) 觀(guān)察結果時(shí)，注意牛乳有無(wú)產(chǎn)酸、產(chǎn)堿、凝固或胨化等反應。注意牛乳產(chǎn)酸、產(chǎn)堿、凝固、胨化各現象是連續出現的，往往觀(guān)察某種現象出現時(shí)，另一種現象已經(jīng)消失了。

實(shí)驗結果及討論 

1．實(shí)驗結果 

(1) 記錄細菌對生物大分子分解利用的各項實(shí)驗及其結果。 

(2) 淀粉、油脂、明膠和酪蛋白等生物大分子物質(zhì)能否不經(jīng)分解而直接被細菌吸收？為什么？ 

(3) 明膠液化試驗中，為什么只能將接種后的培養基置于 20℃溫箱中培養？ 

2．討論 

    針對實(shí)驗原理、步驟、現象進(jìn)行討論。

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