菌種的分離純化技術(shù)——平板劃線(xiàn)法

    劃線(xiàn)的形式有多種，可將一個(gè)平板分成四個(gè)不同面積的小區進(jìn)行劃線(xiàn),第一區(A區)面積最小，作為待分離菌的菌源區，第二和第三區(B、C區)是逐級稀釋的過(guò)渡區，第四區(D區)，則是關(guān)鍵區，使該區出現大量的單菌落以供挑選純種用。為了得到較多的典型單菌落,平板上四區面積的分配應是D＞C＞B＞A。 

實(shí)驗器材 

    大腸桿菌、枯草芽孢桿菌混合菌懸液 

    牛肉膏蛋白胨培養基 

    無(wú)菌培養皿，水浴鍋，接種環(huán)等。 

實(shí)驗步驟 

1．融化培養基：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基放入水浴中加熱至融化。 

2．倒平板：待培養基冷卻至 50℃左右，按無(wú)菌操作法倒 2只平板(每皿約 15m1)，平置，待凝固。 

    倒平板的方法：右手持盛培養基的試管或三角瓶置火焰旁邊，用左手將試管塞或瓶塞輕輕地撥出，試管或瓶口保持對著(zhù)火焰；然后用右手手掌邊緣或小指與無(wú)名指夾住管(瓶)塞(也可將試管塞或瓶塞放在左手邊緣或小指與無(wú)名指之間夾住。如果試管內或三角瓶?jì)鹊呐囵B基一次用完，管塞或瓶塞則不必夾在手中)。左手拿培養皿并將皿蓋在火焰附近打開(kāi)一縫，迅速例入培養基約 15m1，加蓋后輕輕搖動(dòng)培養皿，使培養基均勻分布在培養皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即為平板。 

3．作分區標記在皿底將整個(gè)平板劃分成 A、B、C、D四個(gè)面積不等的區域。各區之間的交角應為120℃左右（平板轉動(dòng)一定角度約 60℃），以便充分利用整個(gè)平板的面積，而且采用這種分區法可使 D區與 A區劃出的線(xiàn)條相平行，并可避免此兩區線(xiàn)條相接觸。 

4．劃線(xiàn)操作 

(1) 挑取他含菌樣品：選用平整、圓滑的接種環(huán)，按無(wú)菌操作法挑取少量菌種。 

(2) 劃 A區：將平板倒置于煤氣 （酒精）燈旁,左手拿出皿底并盡量使平板垂直于桌面，有培養基一面向著(zhù)煤氣燈(這時(shí)皿蓋朝上， 仍留在煤氣燈旁)， 右手拿接種環(huán)先在 A區劃 3—4條連續的平行線(xiàn)(線(xiàn)條多少應依挑菌量的多少面定)。劃完 A區后應立即燒掉環(huán)上的殘菌，以免因菌過(guò)多而影響后面各區的分離效果。在燒接種環(huán)時(shí)，左手持皿底并將其覆蓋在皿蓋上方(不要放入皿蓋內)，以防止雜菌的污染。 

(3) 劃其他區：將燒去殘菌后的接種環(huán)在平板培養基邊緣冷卻一下，并使 B 區轉到上方，接種環(huán)通過(guò) A區(菌源區)將菌帶到 B 區，隨即劃數條致密的平行線(xiàn)。再從 B 區作 C區的劃線(xiàn)。最后經(jīng) C區作 D區的劃線(xiàn)，D區的線(xiàn)條應與 A區平行，但劃 D區時(shí)切勿重新接觸 A、B 區，以免極該兩區中濃密的菌液帶到 D區，影響單菌落的形成。隨即將皿底放入皿蓋中。燒去接種環(huán)上的殘菌。 

5．恒溫培養：將劃線(xiàn)平板倒置，于 37℃ （或 28℃）培養，24hr 后觀(guān)察。