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實(shí)驗目的
1. 明確培養基的配制原理。
2. 掌握配制培養基的一般方法和步驟。
實(shí)驗內容
學(xué)習細菌、放線(xiàn)菌、酵母菌及霉菌四大類(lèi)微生物培養基的配制。
實(shí)驗原理
培養基是人工配制的適合微生物生長(cháng)繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營(yíng)養基質(zhì)，用以培養、分離、鑒定、保存各種微生物或積累代謝產(chǎn)物。
各類(lèi)微生物對營(yíng)養的要求不盡相同，因而培養基的種類(lèi)繁多。培養細菌常用牛肉膏蛋白胨培養基，培養放線(xiàn)菌常用高氏 I 號培養基，培養霉菌常用蔡氏培養基或馬鈴薯培養基，培養酵母菌常用麥芽汁培養基或馬鈴薯葡萄糖培養基。另外還有固體、液體、加富、選擇、鑒別等培養基之分。在這些培養基中，就營(yíng)養物質(zhì)而言，一般不外乎碳源、氮源、無(wú)機鹽、生長(cháng)因子及水等幾大類(lèi)。瓊脂只是固體培養基的支持物，一般不為微生物所利用。它在 96℃以上熔化成液體，而在 45℃左右開(kāi)始凝固成固體。在配制培養基時(shí)，根據各類(lèi)微生物的特點(diǎn)，就可以配制出適合不同種類(lèi)微生物生長(cháng)發(fā)育所需要的培養基。
培養基除了滿(mǎn)足微生物所必需營(yíng)養物質(zhì)外，還要求有一定的酸堿度和滲透壓。霉菌和酵母菌的pH 偏酸；細菌、放線(xiàn)菌的 pH為微堿性。所以每次配制培養基時(shí)，都要將培養基的 pH值調到一定的范圍。
實(shí)驗步驟
1．牛肉膏蛋白胨培養基配制方法
(1) 稱(chēng)量：按培養基配方比例依次推確地稱(chēng)取牛肉膏、蛋白胨、NaCL放人燒杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小燒杯或表面皿中稱(chēng)量，用熱水溶化后倒入燒杯，也可按在稱(chēng)量紙上，稱(chēng)量后直接放入水中，這時(shí)如稍微加熱，牛肉膏便會(huì )與稱(chēng)量紙分離，然后立即取出紙片。
蛋白胨很易吸濕，在稱(chēng)取時(shí)動(dòng)作要迅速。另外，稱(chēng)藥品時(shí)嚴防藥品混雜，一把牛角匙用于一種藥品，或稱(chēng)取一種藥品后，洗凈，擦干，再稱(chēng)取另一藥品。瓶蓋也不要蓋錯。
(2) 溶化：在上述燒杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒攪勻，然后，在石棉網(wǎng)上加熱使其溶解。
將藥品完全溶解后，補充水到所需的總體積，如果配制固體培養基時(shí)，將稱(chēng)好的瓊脂放入己溶的藥品中，再加熱溶化，最后補足所損失的水分。
在瓊脂溶化過(guò)程中，應控制火力，以免培養基因沸騰而溢出容器。同時(shí)．需不斷攪拌．以防瓊脂糊底燒焦。配制培養基時(shí)，不可用銅或鐵鍋加熱溶化，以免離子進(jìn)入培養基中，影晌細菌生長(cháng)。
(3) 調 pH
在未調 pH前，先用精密 pH試紙測量培養基的原始 pH，如果偏酸，用滴管向培養基中逐滴加入 1mol/LNaOH,邊加邊攪拌，并隨時(shí)用 pH試紙測其 pH，直至 pH達 7.6。反之，用 mol/LHCL 進(jìn)行調節。
對于有些要求 pH較精確的微生物，其 pH的調節可用酸度計進(jìn)行。
pH 不要調過(guò)頭，以避免回調而影響培養基內各離子的濃度。配制 pH低的瓊脂培養基時(shí)，若預先調好 pH 并在高壓蒸氣下滅菌，則瓊脂因水解不能凝固。因此，應將培養基的成分和瓊脂分開(kāi)滅菌后再混合，或在中性 pH條件下滅菌，再調整 PH。
(4) 過(guò)濾
趁熱用濾紙或多層紗布過(guò)濾， 以利某些實(shí)驗結果的觀(guān)察。 一般無(wú)特殊要求的情況下可以省去 （本實(shí)驗勿需過(guò)濾）。
(5) 分裝
按實(shí)驗要求，可將配制的培養基分裝人試管內或三角燒瓶?jì)取?nbsp;
1) 液體分裝：分裝高度以試管高度的 l／4 左右為宜。分裝三角瓶的量則根據需要而定，一般以不超過(guò)三角瓶容積的一半為宜，如果是用于振蕩培養用，則根據通氣量的要求酌情減少；有的液體培養基在滅菌后，需要補加一定量的其他無(wú)菌成分，如抗生素等，則裝量一定要準確。
2) 固體分裝：分裝試管，其裝量不超過(guò)管高的 1/5，滅菌后制成斜面。分裝三角燒瓶的量以不超過(guò)三角燒瓶容積的一半為宜。
3) 半固體分裝：試管一般以試管高度的 1/3為宜，滅菌后垂直待凝。
分裝過(guò)程中，注意不要使培養基沾在管(瓶)口上，以免沾污棉塞而引起污染。
(6) 加塞
培養基分裝完畢后，在試管口或三角烷瓶口上塞上棉塞（或泡沫塑料塞及試管帽等），棉塞的作用有二：一方面阻止外界微生物進(jìn)入培養基，防止由此而引起的污染；另一方面保證有良好的通氣性能，使培養在里面的微生物能夠從外界源源不斷地獲得新鮮無(wú)菌空氣。因此棉塞質(zhì)量的好壞對
實(shí)驗的結果有著(zhù)很大的影響。一只好的棉塞，外形應象一只蘑菇，大小、松緊都應適當。加塞時(shí)的棉塞的總長(cháng)度的 3/5應在口內，2/5在口外。
(7) 包扎
加塞后，將全部試管用麻繩捆好，再在棉塞外包一層牛皮紙，以防止滅菌時(shí)冷凝水潤濕棉塞，其外再用一道麻繩扎好。用記號筆注明培養基名稱(chēng)、組別、配制日期。三角燒瓶加塞后，外包牛皮紙，用麻繩以活結形式扎好，使用時(shí)容易解開(kāi)，同樣用記號筆注明培養基名稱(chēng)、組別、配制日期。
(8) 滅菌
將上述培養基以 0.103MPa，121℃，20min高壓蒸氣滅菌。
(9) 擱置斜面
將滅菌的試管培養基冷至 50℃左右 〔以防斜面上冷凝水太多〕，將試管口端捆在玻棒或其他合適高度的器具上，擱置的斜面長(cháng)度以不超過(guò)試管總長(cháng)的一半為宜 。
10) 無(wú)菌撿查
將滅菌培養基放人 37℃的溫室中培養 24—48h，以檢查滅菌是否徹底。
2．高氏 I號培養基配制方法
(1) 稱(chēng)量和溶化
按配方先稱(chēng)取可溶性淀粉、放入小燒杯中，并用少量冷水將淀粉調成糊狀，再加入少于所需水量的沸水中，繼續加熱，使可溶性淀粉完全溶化。然后再稱(chēng)取其他各成分依次逐一溶化。如要配制固體培養基，其溶化過(guò)程同牛肉膏蛋白胨培養基配制方法。
(2) pH調節、分裝、包扎、滅菌及無(wú)菌檢查同牛肉膏蛋白胨培養基配制方法。
3．馬鈴薯培養基配制方法
取去皮馬鈴薯 200g，切成小塊，放入 1500mL的燒杯中煮沸 30min，注意用玻棒攪拌以防糊底。
然后用雙層紗布過(guò)濾，取濾液加糖（酵母菌用葡萄糖，霉菌用蔗糖），加熱煮沸后加入瓊脂，繼續加熱融化并補足失水。再按前所述，進(jìn)行分裝、加塞、包扎、0.1MPa滅菌 20 min。
4．察氏培養基配制方法
方法同牛肉膏蛋白胨培養基配制。
實(shí)驗結果及討論
針對實(shí)驗原理、步驟、現象進(jìn)行討論。
