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綠膿桿菌在自然界分布甚廣，空氣、水、土壤中均有存在。對人有致病力，常引起人皮膚化膿感染，特別是燒傷、燙傷、眼部疾病患者被感染后，常使病情惡化，并可引起敗血癥，因此，在化妝品衛生標準中規定不得檢出綠膿桿菌。
1 方法提要
根據本菌生物學(xué)特征：革蘭氏陰性桿菌，氧化酶陽(yáng)性，能產(chǎn)生綠膿菌素。此外還能液化明膠，還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，在42℃條件下生長(cháng)等，可與類(lèi)似菌相區別。
2 培養基和試劑
2.1 SCDLP 液體培養基
見(jiàn)GB 7918.1-87《化妝品微生物標準檢驗方法 總則》。
2.2 十六烷三甲基溴化銨培養基
成分： 牛肉膏 3g
蛋白胨 10g
氯化鈉 5g
十六烷三甲基溴化銨 0.3g
瓊脂 20g
蒸餾水 1000ml
制法：除瓊脂外，將上述成分混合加熱溶解，調pH為7.4～7.6，加入瓊脂，115℃(10 1b)20min滅菌后，制成平板備用。
2.3 乙酰胺培養基
成分：乙酰胺 10.0g
氯化鈉 5.0g
無(wú)水磷酸氫于鉀 1.39g
無(wú)水磷酸二氫鉀 0.73g
硫酸鎂(MgSO4·7H2O) 0.5g
酚紅 0.012g
瓊脂 20g
蒸餾水 1000ml
制法：除瓊脂和酚紅外，將其他成分加到蒸餾水中，加熱溶解，調pH為7.2，加入瓊脂、酚紅，121℃(15 1b)20min高壓滅菌后，制成平板備用。
2.4 綠膿菌色素測定用培養基
成分： 蛋白胨 20g
氯化鎂 1.4g
硫酸鉀 10g
瓊脂 18g
甘油(化學(xué)純) 10g
蒸餾水 1000ml
制法：將蛋白胨、氯化鎂和硫酸鉀加到蒸餾水中，加溫使溶解，調pH至7.4，加入瓊脂和甘油，加熱溶解，分裝于試管內，115℃(10 1b)20min高壓滅菌后，制成斜面備用。
2.5 明膠培養基
成分： 牛肉膏 3g
蛋白胨 5g
明膠 120g
蒸餾水 1000ml
制法：取各成分加在蒸餾水中浸泡20min，隨時(shí)攪拌加溫使溶解，調pH至7.4，分裝于試管內，經(jīng)115℃(10 1b)20min滅菌后，直立制成高層備用。
2.6 硝酸鹽蛋白胨水培養基
成分： 蛋白胨 10g
酵母浸膏 3g
硝酸鉀 2g
亞硝酸鈉 0.5g
蒸餾水 1000ml
制法：將蛋白胨和酵母浸膏加到蒸餾水中，加溫使溶解，調pH為7.2，煮沸過(guò)濾后補足液量，加入硝酸鉀和亞硝酸鈉，溶解混勻，分裝到加有小倒管的試管中，115℃(10 1b)20min滅菌后備用。
2.7 普通瓊脂斜面培養基
成分：蛋白胨 10g
牛肉膏 3g
氯化鈉 5g
瓊脂 15g
蒸餾水 1000ml
制法：除瓊脂，將其余成分溶解于蒸餾水中，調pH為7.2～7.4，加入瓊脂，加熱溶解，分裝試管，121℃(15 1b)15min高壓滅菌后，制成斜面備用。
３ 儀器
3.1 培養箱：37℃、42℃。
3.2 錐形燒瓶。
3.3 試管。
3.4 滅菌平皿。
3.5 滅菌刻度吸管。
3.6 顯微鏡。
3.7 載玻片。
3.8 接種針、接種環(huán)。
3.9 電爐。
3.10 高壓消毒鍋。
4 操作步驟
4.1 增菌培養：取1：10樣品稀釋液10ml加到90ml SCDLP液體培養基中，置37℃培養18～24h。如有綠膿桿菌生長(cháng)，培養液表面多有一層薄菌膜，培養液常呈黃綠色或藍綠色。
注：如無(wú)SCDLP液體培養基時(shí)，可用普通肉湯培養基。檢驗含防腐劑的化妝品時(shí)，在每1000ml普通肉湯中加1g卵磷脂、7g吐溫80。
4.2 分離培養：從培養液的薄菌膜處挑取培養物，劃線(xiàn)接種在十六烷三甲基溴化銨瓊脂平板上，置37℃培養18～24h。凡綠膿桿菌在此培養基上，其菌落扁平無(wú)守型，向周邊擴散或略有蔓延，表面濕潤，菌落呈灰白色，菌落周?chē)囵B基常擴散有水溶性色素，此培養基選擇性強，大腸艾希氏菌不能生長(cháng)，革蘭氏陽(yáng)性菌生長(cháng)較差。
在缺乏十六烷三甲基溴化銨瓊脂時(shí)也可用乙酰胺培養基進(jìn)行分離，將菌液劃線(xiàn)接種于平皿中，放37℃培養24H，綠膿桿菌在此培養基上生長(cháng)良好，菌落扁平，邊緣不整，菌落周?chē)囵B基略帶紅色，其他菌不生長(cháng)。
4.3 染色鏡檢：挑取可疑的菌落，涂片，革蘭氏染色，鏡檢為革蘭氏陰性者應進(jìn)行氧化酶試驗。
4.4 氧化酶試驗：取一小塊潔凈的白色濾紙片放在滅菌平皿內，用無(wú)菌玻璃棒挑取綠膿桿菌可疑菌落涂在濾紙片上，然后在其上滴加一滴新配制的1％二甲基對苯二胺試液，在15～30s之內，出現粉紅色或紫紅色時(shí)，為氧化酶試驗陽(yáng)性，若培養物不變色，氧化酶試驗陰性。
4.5 綠膿菌素試驗：取可疑菌落2～3個(gè)，分別接種在綠膿菌素測定用培養基上，置37℃培養24h，加入氯仿3～5ml，充分振蕩使培養物中的綠膿菌素溶解于氯仿液內，待氯仿提取液呈藍色時(shí)，用吸管將氯仿移到另一試管中并加入1N的鹽酸1ml左右，振蕩后，靜置片刻。如上層鹽酸液內出現粉紅色到紫紅色時(shí)為陽(yáng)性，表示被檢物中有綠膿菌素存在。
4.6 硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗：挑取被檢的純培養物，接種在硝酸鹽胨水培養基中，置37℃培養24h，觀(guān)察結果。凡在硝酸鹽胨水培養基內的小倒管中有氣體者，即為陽(yáng)性，表明該菌能還原硝酸鹽，并將亞硝酸鹽分解產(chǎn)生氮氣。
4.7 明膠液化試驗，取綠膿桿菌可疑菌落的純培養物，穿刺接種在明膠培養基內，置37℃培養24h，取出放冰箱10～30min，如仍呈溶解狀時(shí)即為明膠液化試驗陽(yáng)性，如凝固不溶者為陰性。
4.8 42℃生長(cháng)試驗：挑取純培養物，接種在普通瓊脂斜面培養基上，放在41～42℃培養箱中，培養24～48h，綠膿桿菌能生長(cháng)，為陽(yáng)性，而近似的熒光假單胞菌則不能生長(cháng)。
5 檢驗結果報告
被檢樣品增菌分離培養后，經(jīng)證實(shí)為革蘭氏陰性桿菌，氧化酶及綠膿菌素試驗皆為陽(yáng)性者，即可報告被檢樣品中檢出有綠膿桿菌。如綠膿菌素試驗陰性而液化明膠、硝酸鹽還原產(chǎn)氣和４２℃生長(cháng)試驗三者皆為隉性時(shí)，仍可報告被檢樣品中有綠膿桿菌。
附加說(shuō)明：
本標準由中國預防醫學(xué)科學(xué)院環(huán)境衛生監測所歸口。
本標準由“化妝品微生物標準檢驗方法”起草小組起草。
本標準主要起草人周淑玉。
本標準由中國預防醫學(xué)科學(xué)院環(huán)境衛生監測所負責解釋
注解：
（1）分離綠膿桿菌常用以下幾種培養基：
1）十六烷三甲基溴化銨瓊脂（CA）
2）明膠十六烷三甲基溴化銨瓊脂（GCA）
成分為：蛋白陳20g，無(wú)水氯化鎂1.4g，無(wú)水硫酸鉀10g，明膠（BG）75g，瓊脂18～20g，十六烷三甲基溴化銨（cetrimide）0.3g，甘油（CP）10ml，蒸餾水1000ml， pH7.6。在本平板上可直接觀(guān)察是否液化明膠（菌落周?chē)幸夯h(huán)），并可測試氧化酶和綠膿色素，提前診斷。
上述這兩種培養基具有較強的選擇性和鑒別作用，除綠膿桿菌和極少數假單胞菌及革蘭氏陰性桿菌可以生長(cháng)外，絕大部分革蘭氏陰性桿菌，假單胞菌及革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(cháng)，完全受到抑制。因為綠膿桿菌具有可利用十六烷的溴化銨鹽這一重要特性，故很多國家已普遍利用此特性分離該菌，證明效果很好。但往往出現無(wú)色素、菌落較小、無(wú)蔓延生長(cháng)等現象，因此在選取菌落時(shí)須注意，以免漏檢。
3）乙酰胺瓊脂培養基（Acetamide）主要成分為乙酰胺。乙酰胺酶是綠膿桿菌特有的酶類(lèi)。綠膿桿菌能分解乙酰胺，故在此培養基上能生長(cháng)，而其他菌不生長(cháng)。
4）NAC瓊脂培養基，其成分為：蛋白陳20g、磷酸氫二鉀和硫酸鎂各0.3g，十六烷三甲基溴化胺（cetrimide）0.2g及萘啶酸（nalidixic acid）15mg（商稱(chēng)NAC），瓊脂15g，加蒸餾水1000m1，pH為7.4。
在NAC培養基中，綠膿桿菌生長(cháng)良好，有些熒光假單胞菌，惡臭假單胞菌和腐敗假單胞菌可緩慢生長(cháng)或不長(cháng)，而大腸埃希氏菌、志賀氏菌、沙門(mén)氏菌、變形桿菌、克雷伯氏菌和腸道桿菌科的其他菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、氣單胞菌屬、弧菌屬以及葡萄球菌和鏈球菌屬等，完全受到抑制不能生長(cháng)。因此NAC培養基是一種選擇性很強的綠膿桿菌培養基。日本采用NAC培養基分離化妝品中綠膿桿菌。 CTFA采用十六烷三甲基溴化銨培養基分離綠膿桿菌。在我國化妝品標準檢驗方法中規定十六烷三甲基溴化銨和乙酰胺二種培養基均可使用，
這是考慮到有的地區十六烷三甲基溴化銨不易買(mǎi)到。
（2）綠膿桿菌與其他常見(jiàn)假單胞菌及革蘭氏陰性桿菌的鑒別。
假單胞菌屬分為四個(gè)菌群：29個(gè)代表菌種。其中同人類(lèi)與動(dòng)物疾病有重要關(guān)系的大約有10種，而綠膿桿菌（pseudomonas aeruginosa）又是其中最有代表性的致病菌種。常見(jiàn)的其他菌種有：熒光假單胞菌（PS flaorescens）、惡臭假單胞菌PS Putida）、蔥頭假單胞菌（PS cepacia）、類(lèi)鼻疽假單胞菌（PS Pseudomallei）、嗜麥芽假單胞（PS maitophilia）、腐敗假單胞菌（PS Putretf aciens）、斯氏假單胞菌（PS Stutzeri）、產(chǎn)堿假單胞菌（PS alcaligenes）和類(lèi)產(chǎn)堿假單胞菌（PS Pseudoalcaligenes）等九種。此外，在日常檢驗工作中尚有一些非假單胞菌屬的其他革蘭氏陰性桿菌，如氧化木糖無(wú)色桿菌（A xy-losoxidans）、產(chǎn)堿桿菌屬(AlcaligenesSP)和糞產(chǎn)堿桿菌（A faecalis）等均容易與上述假單胞菌混淆，主要鑒別列表
（3）綠膿桿菌血清學(xué)試驗
在微生物諸多研究方法中，血清學(xué)方法是重要方法之一，被廣泛應用于實(shí)驗診斷中。
對綠膿桿菌血清分型的研究，早在1903年Eisenberg就已致力于這一工作。我國也進(jìn)行了大量工作，以O抗原為依據，研制成了國際抗原分型系統（IATS）20型分型血清，分型率達99.4％，是當前各國分型系統中分型率高的分型方案。
綠膿桿菌血清學(xué)試驗采用玻片凝集法。先用PI～PⅣ多價(jià)血清分別與待檢活菌培養物作凝集試驗，陽(yáng)性者再用單價(jià)分型血清作凝集試驗。判斷標準：立即出現強凝集（＋＋＋＋），3～5ｓ出現強凝集（＋＋＋），6～10s出現凝集（＋＋）， 11～15s出現凝集（＋）,16～30s不出現凝集（一），以（＋＋）以上為陽(yáng)性結果。
對綠膿桿菌既作生化鑒定,又作血清凝集試驗,更有利于結果的判定。
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