克雷伯氏菌ZD112氯氰菊酯降解酶基因的克隆與生物信息學(xué)分析

【摘要】  目的 篩選新的菊酯農藥降解酶基因并了解其特性，為解決食品和環(huán)境中的菊酯農藥殘留問(wèn)題創(chuàng )造條件。方法 通過(guò)構建基因文庫的方式篩選獲得新的菊酯農藥降解酶 (EstP) 基因，并對其進(jìn)行一系列生物信息學(xué)分析。結果 獲得了新的菊酯農藥降解酶 (EstP) 基因。EstP 屬于水解酶類(lèi)，由 638 個(gè)氨基酸編碼，預測分子量為 73.4 kDa，pI 值為 8.34，與其他蛋白相似性極低，不屬于任何已知的蛋白超家族，僅與羧肽酶Taq (M32) 的保守域具有一定相似性，推測 Lys137, Glu116, Glu148 為其必需氨基酸。 結論 新的菊酯農藥降解基因得到克隆，生物信息學(xué)分析為其定向進(jìn)化提供了理論指導，為高效基因工程菌的構建打下了基礎。

【關(guān)鍵詞】  菊酯農藥降解酶；基因克��；菊酯農藥；生物信息學(xué)分析

　　擬除蟲(chóng)菊酯為第三代殺蟲(chóng)劑，其長(cháng)期廣泛的使用，對土壤、大氣和水源等造成了不同程度的污染［1］ 。其對健康的危害也不容忽視，主要包括對免疫系統的脅迫，對淋巴結和脾臟的損傷、致癌以及環(huán)境激素效應等［2］ 。尋找一種有效方法消除或降低食品和環(huán)境中的菊酯農藥殘留已成為當前迫切需要解決的問(wèn)題。
    　　
　　在過(guò)去的研究工作中，本實(shí)驗室獲得了一株能以菊酯為唯一碳源和氮源生長(cháng)的伯雷克氏菌株Klebsiella sp. ZD112，鑒于直接應用農藥降解酶制劑比應用產(chǎn)酶的菌劑更有優(yōu)勢［3］，為了能夠產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)菊酯農藥降解酶，通過(guò)構建基因文庫的方式獲得了新的菊酯農藥降解酶基因，并進(jìn)行了一系列生物信息學(xué)分析，為高效基因工程菌的構建打下基礎。

　　1  材料與方法

　　1.1  培養基
    　　
　　LB培養基與LA培養基按照分子克隆手冊配制。篩選培養基為加入 100 mg/L 氨芐青霉素（ampicillin）和100 μmol/L 5�瞓romo��4�瞔hloro��3�瞚ndolylcaprylate (X�瞔aprylate)的 LB培養基（X�瞔aprylate可被水解酶水解而形成藍色的水解圈［4］）。

　　1.2  菌株
      
　　大腸桿菌DH5α ［supE44, Δ lacU169 (φ80 lacZΔM15), hsdR17, recA1, endA1, gyrA96, thi��1, relA1］由本實(shí)驗室保存，菊酯農藥降解酶生產(chǎn)菌株Klebsiella sp. ZD112 菌株由本實(shí)驗室從污染土壤分離。pUC18質(zhì)粒購自TaKaRa公司。

　　1.3  酶和試劑
      
　　各種限制性?xún)惹忻�、DNA marker、X�睪al、IPTG購自TaKaRa公司,T4連接酶、去磷酸化酶購自MBI公司。其他生物化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

　　1.4  基因文庫的構建
      
　　參照分子克隆手冊提取Klebsiella sp.ZD112基因組DNA和pUC18質(zhì)粒。ZD112基因組DNA經(jīng)HindⅢ不完全酶切后電泳，按照3 S DNA Gel Purification kit試劑盒說(shuō)明書(shū)割膠回收2～10 kb片斷。pUC18經(jīng) HindⅢ酶切后去磷酸化后并電泳，割膠回收。將酶切并回收的DNA片斷與去磷酸化的克隆載體按5∶1的比例16 ℃連接過(guò)夜，Ca轉入大腸桿菌DH5α，并涂布LA平板，進(jìn)行藍白斑篩選。

　　1.5  目標亞克隆的篩選
　挑取白色的轉化子到含酯酶底物(X�瞔aprylate)的篩選平板上培養過(guò)夜，挑取有藍色水解圈形成的轉化子保存并接種于LA液體培養基中振蕩培養。提取質(zhì)粒酶切驗證，同時(shí)破碎菌體提取粗酶液,測定其對氯氰菊酯的降解率。

　　1.6亞克隆測序與分析
       
　　測序由上海博亞生物公司完成。對插入片斷通過(guò)ORF Finder ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf.html )尋找讀碼框，并采用BLASTn ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ )進(jìn)行同源性分析。
  
　　1.7  目的基因生物信息學(xué)分析
      
　　分子量和等電點(diǎn)計算采用DNAstar5.0 軟件計算；蛋白保守域查詢(xún)采用rpsBlast ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/ wrpsb.cgi )，數據庫選擇為 CDD v2.06-11530 PSMMs，鑒于 EstP 與其他蛋白的同源性非常低，E 值選擇時(shí)適當放寬，設為 1；酶與非酶分析采用基于蛋白氨基酸序列性質(zhì)的 ArchaeaFun 1.0 Server (http://genome.cbs.dtu.dk/ services/Archaea Fun)；蛋白超家族分析采用基于隱馬爾科夫 (Hidden Markov Model, HMM) 算法的 Superfamily 1.61 (http://supfam.mrc�瞝mb.cam.ac.uk/SUPERFAMILY/) ，參數選擇：example sequence: Amino acid sequence，Scoring options: Local/local model/sequence scoring，Blast Pre�瞗ilter P�瞯alue<10e��10；蛋白亞細胞定位采用 Loctree 服務(wù)器(http://cubic.bioc.columbia.edu/services/loctree/ )；EstP的多序列比對使用 Clustal X 軟件，相似序列由rpsBlast 獲得，蛋白勢能矩陣選擇為 Blosum series。

　　2  結果與分析

　　2.1  基因文庫的構建
                
　　通過(guò)藍白斑篩選，共獲得白色克隆約3萬(wàn)個(gè)。ZD112基因組DNA不完全酶切結果見(jiàn)圖1，質(zhì)粒pUC18的Hind Ⅲ酶切圖見(jiàn)圖2。

　　2.2  目標亞克隆的篩選與鑒定
       
　　挑取1 500個(gè)陽(yáng)性克隆至到含底物（X�瞔aprylate）篩選培養基。獲得4個(gè)能在篩選培養基產(chǎn)生藍色水解圈的單菌落，挑取后加入Amp含量為100 mg/L的 LB液體培養基培養,甘油保存。其粗酶液對氯氰菊酯的降解率見(jiàn)表1，ZD112粗酶液作對照［5］。
       
　　挑選降解率高的陽(yáng)性克隆子LA5進(jìn)行酶切（圖3），從圖中可知，L5A 連接上了大約3.6 kb左右的片段,送測序公司測序(圖4) 。

    用NCBI上的工具ORF finder分析LA5的克隆片段,發(fā)現其含有2個(gè)較大的開(kāi)放讀碼框(ORF),一個(gè)長(cháng)度為1 914 bp(ORF1，登錄號: AY995176),另外一個(gè)長(cháng)度為756 bp(ORF2，登錄號: AY954696)。其中ORF1僅與2個(gè)細菌預測蛋白有一定相似性（hypothetical protein SC171：88%相似；ebA4602：36 %相似），并含有-10,-35以及RBS(ribosomal binding site)序列（圖5），因此該ORF可能是編碼菊酯降解酶 (EstP) 的新基因。表1  各陽(yáng)性克隆與ZD112的降解率（略）

　　2.3  生物信息學(xué)分析結果
    　　
　　EstP由637 個(gè)氨基酸組成，經(jīng)DNAstar5.0計算出其分子量為 73.4 kDa，pI 值為 8.34。蛋白亞細胞定位分析結果顯示，EstP 屬于細胞質(zhì)內蛋白。酶與非酶的分析結果表明，EstP 是酶，并且屬于水解酶類(lèi)。
    　
　　進(jìn)一步分析發(fā)現，EstP 不屬于任何已知的蛋白超家族，與 EstP 具同源性的已知蛋白也非常少。rpsBlast 分析表明，EstP 僅有一段很短的序列（71～149氨基酸區段）與羧肽酶 Taq (M32) 的保守域有最高的相似性，這段序列還與預測膜蛋白 COGO0012 有一定的相似性。

    通過(guò)對已知結構蛋白 Taq (M32) 的三級結構的分析發(fā)現，其與 EstP 具有同源性的序列呈 V 字型，且Taq (M32) 的活性位點(diǎn)正位于這一區段內，由此，推測 EstP 的活性中心可能位于其 71～149 氨基酸區段內。

　　3  討 論
    　　
　　作為目前最有發(fā)展前途的殺蟲(chóng)劑，擬除蟲(chóng)菊酯尚未找到新型的替代化合物，在未來(lái)十幾年內仍將廣泛使用。采用微生物農藥降解酶解決菊酯農藥殘留污染問(wèn)題是當前環(huán)境科學(xué)研究的熱點(diǎn),也是一個(gè)較新的研究領(lǐng)域。由于農藥降解酶在野生菌株中含量太低，生產(chǎn)成本高昂且難以大量生產(chǎn)，如何產(chǎn)業(yè)化地生產(chǎn)農藥降解酶成為農藥降解酶應用必須解決一個(gè)關(guān)鍵性問(wèn)題。農藥降解酶基因的克隆、表達以及定向進(jìn)化可以構建出降解譜廣、降解能力強的工程菌，為微生物降解農藥開(kāi)辟了新途徑。
    　　
　　在之前的研究中，本實(shí)驗室從農藥廠(chǎng)的污泥中篩選出能降解菊酯農藥的伯雷克氏菌株 Klebsiella sp. Strain ZD112 。通過(guò)構建基因文庫的方式，獲得了一個(gè)具有菊酯降解活性的克隆子，對測序結果進(jìn)行 ORF 分析，該ORF1在NCBI上比對的結果都是一些細菌的預測蛋白，如：它與Salmonella enterica subsp. enterica serovar Choleraesuis的預測蛋白hypothetical protein SC171(登錄號: AAS76447.1)有88%一致性；與Azoarcus sp. EbN1的預測蛋白ebA4602(登錄號: YP159633.1)有36 %的一致性。他們的功能都還沒(méi)有確定,目前為止尚未見(jiàn)有菊酯類(lèi)農藥降解基因的報道。因此本研究克隆出來(lái)的基因有可能是一個(gè)新的菊酯農藥降解基因。
    　　
　　對該基因的生物信息學(xué)分析顯示，EstP 為水解酶且為胞內蛋白，這與前期實(shí)驗結論完全吻合［5］。根據其與羧肽酶 Taq (M32) 保守域所表現的較高相似性，推測其氨基酸序列的 71～149 為其活性中心所在，必需氨基酸為 Glu116, Lys137，Glu148，這一結論的得出為 EstP 的定向進(jìn)化提供了理論指導。然而，EstP 與其他已知蛋白序列相似性極低，且不屬于任何蛋白超級家族，這增加了對其研究的難度。
    　　
　　對這樣一個(gè)全新水解酶的進(jìn)一步研究，一方面，可深入了解菊酯降解酶的作用機制［6］，具有深刻的理論意義；另一方面，高效工程菌的開(kāi)發(fā)有助于菊酯農藥殘留降解，在保護生態(tài)環(huán)境、突破綠色壁壘、維護人民健康等方面具有很大的應用潛力。

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