分子生物學(xué)技術(shù)在微生物檢驗中的應用（2）

分子生物學(xué)技術(shù)在細菌鑒定中的應用

十九世紀，細菌的鑒定主要依靠細菌的表型特征，因耗時(shí)長(cháng)，往往耽誤了對疾病診斷與治療。隨著(zhù)分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展及在臨床微生物學(xué)檢驗中的應用，為微生物學(xué)實(shí)驗室對細菌的快速鑒定，尤其是對難分離細菌的快速鑒定，提供了有利條件。目前在細菌鑒定中應用的分子生物學(xué)技術(shù)主要有核酸探針和核酸擴增技術(shù)等。

1．核酸探針技術(shù)

應用核酸探針技術(shù)檢測病原微生物核酸是臨床診斷學(xué)的重大發(fā)展，其原理是用帶有酶、化學(xué)熒光物、放射性核素或生物素標記的已知序列特定DNA片段（稱(chēng)為探針），在一定條件下，按堿基互補原則探針與待測標本中的核酸雜交，通過(guò)對雜交信號的檢測，從而鑒定標本中有無(wú)相應的病原微生物基因及其分子大小。常用核酸探針技術(shù)有固相雜交（斑點(diǎn)雜交、原位雜交、Southern印跡、Northern印跡等。）和液相雜交技術(shù)。

核酸探針適用于直接檢出臨床標本中的病原微生物，不受非病原微生物的影響，因此對某些尚不能分離培養或很難分離培養的微生物的檢測具有重要的意義。隨著(zhù)探針標記的不斷改進(jìn)，檢測試劑盒商品化，操作更簡(jiǎn)便易行。

核酸擴增技術(shù)

核酸擴增（又稱(chēng)基因或DNA擴增）技術(shù)是體外酶促合成DNA片段的新方法，其原理類(lèi)似于DNA的體內半保留復制。主要由高溫變性、低溫退火和適溫延伸三個(gè)步驟反復的熱循環(huán)構成。即在高溫下（95℃）下，待擴增的靶DNA雙鏈受熱變性成為兩條單鏈DNA模板；而后在低溫（37~55℃）情況下，兩條人式合成的寡核苷酸引物與互補的單鏈DNA模板結合，形成部分雙鏈；在Taq酶的最適溫度（72℃）下，以引物的3`端為合成的起點(diǎn)，以單核苷酸為原料，沿模板以5` 3`方向延伸，合成DNA新鏈。這樣每一雙鏈DNA模板，經(jīng)過(guò)一次解鏈、退火、延伸三個(gè)步驟的熱循環(huán)后就成了兩條雙鏈DNA分子。如此反復進(jìn)行，每一次循環(huán)所產(chǎn)生的DNA均能成為下一次循環(huán)的模板，每一次循環(huán)都使人工合成的引物間的DNA特異區段拷貝數擴增一倍。經(jīng)過(guò)上述25~40個(gè)循環(huán)后，靶序列可以擴增成106~108。

核酸擴增技術(shù)（或稱(chēng)聚合酶鏈反應技術(shù)，PCR）具有高敏感性、高特異性、簡(jiǎn)便、快速等特點(diǎn)，臨床實(shí)驗室常用PCR技術(shù)來(lái)檢測標本中某些微生物，尤其是對難以培養微生物的檢測。其它用于檢測微生物的PCR技術(shù)還有：RT-PCR、巢式PCR、多重PCR和隨機引物PCR等。核酸擴增技術(shù)在臨床微生物學(xué)檢驗中的應用見(jiàn)表6-4-2。

表6-4-2 核酸擴增技術(shù)在臨床微生物學(xué)檢驗中的應用

微生物種類(lèi) 核酸擴增技術(shù) 應 用

金黃色葡萄球菌 多重PCR 對mecA基因檢測

凝固酶陰性葡萄球菌 多重PCR 對mecA基因檢測

肺炎鏈球菌 PCR 自溶酶和青霉素結合酶的檢測

化膿性鏈球菌 PCR M蛋白基因的菌株分型

淋病奈瑟菌 LCR 尿道分泌物標本直接檢測

百日咳桿菌 PCR、巢式PCR 臨床標本檢測

結核分枝桿菌

PCR、SDA、Qbeta 肺結核的診斷、呼吸道標本檢測、臨床標本直接檢測

鳥(niǎo)分枝桿菌復合群 PCR 鳥(niǎo)分枝桿菌和胞內分枝桿菌的區別

白喉棒狀桿菌 PCR 產(chǎn)毒菌株的檢測

腸致病性大腸埃希菌 多重PCR 產(chǎn)毒菌株檢測

傷寒、副傷寒沙門(mén)菌 PCR 耐藥質(zhì)粒分型和檢測

幽門(mén)螺桿菌 多重PCR 胃活檢組織細菌檢測

小腸結腸炎耶爾森菌 PCR 菌株分型

彎曲菌屬 PCR 通過(guò)16s rRNA鑒定

杜克雷嗜血桿菌 多重PCR 生殖道潰瘍病人的直接檢測

嗜肺軍團菌 PCR 與爆發(fā)相關(guān)菌株的分型

金氏桿菌屬 PCR 臨床標本鑒定

念珠菌屬 PCR 通過(guò)“DNA”指紋鑒定

梅毒螺旋體 多重PCR 生殖道潰瘍標本直接檢測

伯氏螺旋體 巢式PCR 治療前、中、后檢測

問(wèn)號狀鉤端螺旋體 PCR 鉤端螺旋體血清型的鑒定

CDC group Ⅳ 群 PCR 分型

沙眼衣原體 PCR 無(wú)癥狀病人的診斷

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