分子生物學(xué)技術(shù)在微生物檢驗中的應用（1）

一、分子生物學(xué)技術(shù)在細菌分類(lèi)中的應用

細菌的傳統分類(lèi)法和數值分類(lèi)法以表型特征相似性為基礎，而單純表型相似性還不能準確地確定系統發(fā)育關(guān)系。隨著(zhù)分子生物學(xué)及遺傳學(xué)的發(fā)展，細菌分類(lèi)學(xué)中發(fā)展了一系列核酸分析方法，包括DNA分子中G＋C百分含量測定、DNA-DNA雜交、16S rRNA相關(guān)度分析等。

DNA分子中G＋C百分含量的測定

細菌DNA G+C或A+T摩爾百分比能反映細菌間DNA分子同源程度，不同種屬間G+C mol%范圍在25%~ 75%之間，但同一種細菌G+C mol%相當穩定，不受菌齡、培養條件和其他外界因素影響，親緣關(guān)系越近的細菌，G+C mol%越相近，親緣關(guān)系較遠的細菌G＋Cmol%也不同，但G＋Cmol%相同或近似其親緣關(guān)系不一定相近。最常用的測定方法是熱變性溫度法，其次是高效液相色譜法和浮力密度法。

DNA-DNA雜交

DNA雜交可得出DNA之間核苷酸順序的互補程度，從而推斷不同細菌基因組間的同源性。目前最常用的是復性速率法，變性DNA在溶液中復性（雜交）時(shí)，同源DNA的復性速率比異源DNA要快，同源性愈高，復性速率愈快。復性的過(guò)程也伴隨著(zhù)260nm紫外吸收的減少，再通過(guò)分光光度計直接測定變性DNA在一定條件下的復性速率，最后用理論推導的公式來(lái)計算DNA之間的同源性。同一菌的復性率為100%，80%~90%同源為同一種內同一亞種的細菌，60%~70%同源為同一種內不同亞種的細菌，20%~60%同源則是同一屬中的不同菌種。這種方法還可對新菌種或表型性狀差別很小而難以肯定的菌株做出較可靠的判定，并可修正其他方法的分類(lèi)和鑒定錯誤。

3．16S rRNA同源性分析

(1) rRNA-DNA雜交：變性rRNA與變性DNA混合時(shí)，rRNA與其互補的DNA鏈形成雜交雙鏈，rRNA分子與異源DNA雜交時(shí)，也能在其同源區形成互補雙鏈，這種雜交雙鏈的穩定性與其同源性成正相關(guān)，適于細菌屬及屬上水平的分類(lèi)研究�，F最常用的是硝酸纖維膜結合法。

(2)16S rRNA序列測定：rRNA分子具有高度保守性，在所有的細胞生物中都存在，在長(cháng)期的進(jìn)化中，16S rRNA的總堿基數有所不同，保守的部分使不同序列很容易相互對齊進(jìn)行比較。1985年Lane等提出了改良的Sanger雙脫氧鏈終止法測定rRNA序列，以rRNA為模板，以一個(gè)或多個(gè)寡核苷酸鏈做引物（與rRNA分子上的一段保守區域互補的15~20個(gè)核苷酸），用反轉錄酶合成反轉錄DNA。隨著(zhù)PCR技術(shù)的成熟，出現了利用PCR技術(shù)擴增16S rRNA基因（rDNA），然后采用Sanger法分析rDNA序列的方法，該法比前者更方便。當前的細菌分類(lèi)要求測定16S rRNA基因的全序列來(lái)進(jìn)行比較。16S rRNA基因序列分析技術(shù)是建立系統分類(lèi)的主要技術(shù)，有人建議DNA相關(guān)性≥70%，16S rRNA序列差異≤1%~1.5%的細菌屬于同一種，這使細菌的種有一個(gè)穩定和統一的標準。

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