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1 、營(yíng)養源濃度的控制
由于大多數基因重組菌不能把所需的基因產(chǎn)物分泌到胞外，而只能靠破碎細胞后提取，因此要獲得基因產(chǎn)物，首先必須得到大量菌體。為此基因重組菌的發(fā)酵一般采用高濃度菌體培養的方法，如大腸桿菌培養時(shí)最高可達 125g 干菌體 /L 發(fā)酵液，釀酒酵母可達 145g 干菌體 /L 發(fā)酵液。但要得到高濃度菌體，必須要提供高濃度的營(yíng)養物質(zhì)，而營(yíng)養源濃度過(guò)高，滲透壓也就高，反過(guò)來(lái)又會(huì )抑制重組菌的生長(cháng)。此外，許多基因重組菌常是維生素或氨基酸的營(yíng)養缺陷型菌株，為維持菌體生長(cháng)，也必須添加必需量的生長(cháng)因子營(yíng)養物。常采用在調節 pH 的同時(shí)補加氨基酸混合液和葡萄糖的方法。使整個(gè)培養期間，葡萄糖和氨基酸的濃度幾乎保持恒定，菌體持續以最高生長(cháng)速度生長(cháng)，得到高濃度菌體。
2 、質(zhì)粒的不穩定性及其控制
在重組菌工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中，質(zhì)粒的不穩定性是一個(gè)極為重要而獨特的問(wèn)題。帶有質(zhì)粒的細胞生長(cháng)較慢，生長(cháng)速率與所帶質(zhì)粒的大小成反比。此外，高水平克隆基因產(chǎn)物的生成也會(huì )導致生長(cháng)緩慢或生長(cháng)異常（表達越高，生長(cháng)越慢）。由于質(zhì)粒的不穩定性，在繁殖傳代過(guò)程中還會(huì )有一部分細胞部分甚至完全丟失質(zhì)粒，導致所需產(chǎn)物的產(chǎn)量下降。
質(zhì)粒不穩定包括分離性不穩定和結構性不穩定兩種類(lèi)型。前者是細胞分裂過(guò)程中質(zhì)粒沒(méi)有分配到子細胞中而導致整個(gè)質(zhì)粒的丟失；后者是由于重組質(zhì)粒 DNA 發(fā)生缺失、插入或重排而引起的質(zhì)粒結構變化。
為了在工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)使質(zhì)粒的丟失降低到最低程度，除了構建合適的重組菌外，還應對重組菌進(jìn)行一系列發(fā)酵試驗，選擇最佳的發(fā)酵條件。
使質(zhì)粒穩定的主要措施：首先是組建合適載體和選擇適當宿主，關(guān)于這兩項措施應在構建攜帶質(zhì)粒工程菌時(shí)即應加以考慮。在發(fā)酵過(guò)程中可以：
（ 1 ）、施加選擇壓力
利用某些生長(cháng)條件，只讓那些具有一定遺傳特性的細胞才能夠生長(cháng)。在重組菌發(fā)酵時(shí)，常采取這種方法來(lái)消除重組質(zhì)粒的不穩定性，以提高菌體純度和發(fā)酵生產(chǎn)率。
抗生素添加法 因重組菌中常含有抗藥性基因，因此可添加相應的抗生素來(lái)限制非重組菌的生長(cháng)。但由于抗生素的存在往往在一定程度上會(huì )影響目的產(chǎn)物的合成，增加產(chǎn)物提取的難度，而且對一些易被酶水解失活的抗生素來(lái)說(shuō)，添加抗生素所造成的選擇壓力只能維持一定的時(shí)間。如帶 Ap r 基因的克隆株在 Ap 濃度為 50 、 200 、 1000μg/mL 的培養基中培養 16 小時(shí)后，含有重組質(zhì)粒的細胞數占總細胞數的比例分別為 40% 、 60% 和 100% ，再加上發(fā)酵過(guò)程中受成本的限制，所以大規模生產(chǎn)時(shí)此法并不可取。
抗生素依賴(lài)型變異法 通過(guò)誘變使受體細胞成為某抗生素的依賴(lài)型突變株，即只有在該抗生素存在時(shí)受體細胞才能生長(cháng)，而重組質(zhì)粒上含有該抗生素的非依賴(lài)基因，將重組質(zhì)粒導入后，克隆菌能在不含抗生素的培養基中生長(cháng)。此方法可節約大量抗生素，但克隆菌易發(fā)生回復突變。
營(yíng)養缺陷型法 受體細胞是營(yíng)養缺陷型的，不能在選擇性培養基上生長(cháng)，而質(zhì)粒中含有此基因，克隆后克隆株能在選擇性培養基上生長(cháng)。如構建帶色氨酸操縱子的重組質(zhì)粒 pBR322-trp ，在質(zhì)粒上插入 serB 基因，而受體細胞是 serB 缺陷型的，因此只有重組菌才能在不含 Ser 的培養基上生長(cháng)。
（ 2 ）、控制基因過(guò)量表達
由于外源基因表達水平越高，重組菌往往越不穩定。因此一般采用兩階段培養法，即在發(fā)酵前期控制外源基因不過(guò)量表達，使重組質(zhì)粒穩定地遺傳，到后期，通過(guò)提高質(zhì)粒的拷貝數或轉錄翻譯效率，使外源基因高效表達。
可誘導啟動(dòng)子 在構建表達質(zhì)粒時(shí)，可以使用可誘導的操縱子，如 lac 、 trp 等。在用含有這些啟動(dòng)子的克隆菌進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)，可以選擇培養條件使啟動(dòng)子受阻遏（抑制）至一定時(shí)期，在此期間質(zhì)粒穩定地遺傳，然后通過(guò)去阻遏（誘導），使質(zhì)粒高效表達，例如利用 3-β- 吲哚乙酸可以使 trp 啟動(dòng)子去阻遏。
溫度敏感型質(zhì)粒 某些質(zhì)粒在溫度較低時(shí)，質(zhì)�？截悢瞪�，溫度升高后，大量擴增，這種質(zhì)粒稱(chēng)“脫韁質(zhì)�！保� runaway plasmid ），如 pKN402 和 pKN410 在 30℃ 時(shí)拷貝數為 20~50 個(gè) / 大腸桿菌細胞，而 35℃ 時(shí)大量復制。若將 β- 內酰胺酶基因接在此質(zhì)粒中，經(jīng)熱誘導后， β- 內酰胺酶活力可增強 400 倍。
（ 3 ）、控制培養條件
培養基組成 不同的培養基能影響微生物的代謝活動(dòng)，也能影響質(zhì)粒的穩定性。有人認為質(zhì)粒在豐富培養基中比在最低限量培養基中更加不穩定。
培養溫度 含有重組質(zhì)粒的克隆菌的比生長(cháng)速率往往比受體菌要小，同樣質(zhì)粒導入受體菌后會(huì )使受體菌的生長(cháng)溫度改變。通常而言，低溫有利于重組質(zhì)粒穩定地遺傳。
菌體比生長(cháng)速率 調整重組菌及受體菌的比生長(cháng)速率可以提高重組質(zhì)粒的穩定性，但要做到這一點(diǎn)非常困難，因為大多數環(huán)境條件可同時(shí)提高或降低這兩種菌的比生長(cháng)速率。在某些情況下，可以利用分解代謝物效應控制菌的比生長(cháng)速率，來(lái)提高重組質(zhì)粒的穩定性。如在重組質(zhì)粒中克隆入抗高濃度抑制的某個(gè)基因，這樣在進(jìn)行高濃度底物培養時(shí)，受體菌被抑制，比生長(cháng)速率下降，而重組菌仍能正常生長(cháng)。
綜上所述，選定一個(gè)合適的受體菌十分重要�；蚬こ滩僮髦谐Ｓ玫氖荏w菌是大腸桿菌，它最大的缺點(diǎn)是代謝產(chǎn)物很難分泌出胞外，讓枯草芽孢桿菌把代謝產(chǎn)物分泌出來(lái)是可能的，但由于產(chǎn)芽孢，難于培養到高濃度，而不產(chǎn)芽孢的變易株往往很難培養，因此應該適當考慮用其他微生物作受體。
為了高效率地生產(chǎn)代謝產(chǎn)物，還應考慮每個(gè)細胞的質(zhì)粒數、質(zhì)粒的穩定性及轉錄和翻譯的效率等。質(zhì)粒越多，產(chǎn)量越高，但增殖速度越慢，而且質(zhì)粒越易脫落，脫落的速度越快；表達水平越高，重組質(zhì)粒越不穩定。因此在實(shí)際生產(chǎn)中可考慮用兩階段培養方式，第一階段主要考慮增殖，第二階段主要考慮目的基因的表達。也可通過(guò)改變溫度、用雙罐連續培養等方式，或用添加或去除藥劑的方法來(lái)提高基因產(chǎn)物的產(chǎn)量。
3 、工程菌外逸的控制
由構建的工程菌所攜帶的轉入基因對于環(huán)境的長(cháng)期安全性仍具有風(fēng)險性，目前有關(guān)法規都明確規定工程菌不能擴散到自然環(huán)境中，因此應采取以下措施以防菌體外逸。
（ 1 ）、排氣控制 排出的氣中含有大量氣溶膠，在劇烈起泡的培養物中，培養液呈泡沫狀，它們從排氣口向外排出，重組菌也容易隨之外漏。
控制辦法：在通用通氣型培養罐上安裝排氣鼓泡器（見(jiàn)圖 7-13 ），氣體通過(guò)排氣管到鼓泡瓶，再通過(guò)膜濾器，瓶中可加入殺菌劑（如 2N NaOH ），或用電熱器將排氣加熱至 200℃ ，殺滅工程菌。
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