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（一）檢驗
1、增菌培養
取回的樣品應在4℃下處理、存放和運送，如果是冷凍樣品，則在檢驗前要保持冷凍狀態(tài)。
取25mL液體或25g半固體或固體樣品放入含有225mL無(wú)選擇性試劑增菌肉湯（EB）的均質(zhì)杯中進(jìn)行均質(zhì)，然后轉入三角瓶中，30℃培養4h，加入選擇性試劑吖啶黃素、萘啶酮酸和放線(xiàn)菌酮，繼續培養20h和44h.。
2、分離
共培養24h和48h后，取EB培養物分別在OXA和LPM或加七葉苷/Fe3+LPM瓊脂平板上劃線(xiàn)。PALCAM瓊脂可替代LPM瓊脂。將OXA和PALCAM平板置于35℃培養24-48h，LPM平板在30℃培養24-48h。然后，把LPM平板放于解剖鏡載物臺上，以450角入射光從平板下面照射平板，通過(guò)目鏡垂直向下觀(guān)察尋找可疑菌落。李斯特氏菌在LPM平板上呈有光澤的蘭色或灰色。用已知陽(yáng)性菌和陰性菌劃線(xiàn)的平板作對照。
加入七葉苷和Fe3+的LPM平板不用斜射光系統，選擇可疑菌落的方法與在OXA上選擇可疑菌落的方法相同。在OXA平板上李斯特氏菌菌落周?chē)幸粋�(gè)黑色環(huán)，其它菌也可形成黑色環(huán)，但形成時(shí)間要在兩天以上。李斯特氏菌在PALCAM和OXA平板上的菌落特征相似。
在PALCAM和OXA或LPM平板上挑取5個(gè)或更多的典型菌落，分別劃線(xiàn)于TSAYE平板上以得到更純、更典型的單個(gè)菌落。食品檢驗中在TSAYE平板上純化是必須的，因為在PALCAM和OXA或LPM平板上分離菌落時(shí)可能沾有不可見(jiàn)的受抑微生物。挑取5個(gè)典型菌落的原因是一個(gè)樣品中可能分離到一種以上的李斯特氏菌。30℃TSAYE平板培養24-48h，如果不用于動(dòng)力觀(guān)察，也可在35℃培養。
3、鑒定步驟
�。�1）觀(guān)察TSAYE平板通過(guò)斜射光觀(guān)察，尋找呈蘭灰至蘭色菌落。在TSAYE上用已知菌作對照。
�。�2）、從30℃或更低溫度下培養的TSAYE平板上挑取典型菌落做成濕玻片在油鏡下觀(guān)察。濕玻片用0.85%生理鹽水菌懸液制成。如果菌量太少，菌體黏附于載玻片上而呈現非運動(dòng)性。李斯特氏菌是細短桿菌，可見(jiàn)輕微的旋轉及翻滾。與已知的李斯特氏菌的對照相比，球形、大的桿狀且快速泳動(dòng)的都不是李斯特氏菌。
�。�3）挑取典型菌落進(jìn)行過(guò)氧化氫酶實(shí)驗，李斯特氏菌呈過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性反應。
�。�4）取16-24h的培養物進(jìn)行革蘭氏染色，李斯特氏菌呈革蘭氏陽(yáng)性桿菌。但是陳舊培養物革蘭氏染色會(huì )發(fā)生變化，而且菌體可成球形。在染色過(guò)重的玻片上菌體有呈柵狀排列的趨勢，易誤認為白喉菌而錯判。
�。�5）挑取典型菌落接種于TSBYE肉湯管中，35℃培養24h用做糖類(lèi)發(fā)酵和其它生化項目實(shí)驗。TSBYE肉湯管在4℃下可存放幾天，也可反復接種。
�。�6）在TSAYE平板上挑取典型菌落刺種到5%的綿羊血或馬血瓊脂平板上，刺種時(shí)避免觸到平板底部和使瓊脂破裂，同時(shí)設陽(yáng)性對照（單核細胞增生李斯特氏菌和綿羊李斯特氏菌）和陰性對照（英諾克李斯特氏菌），35℃培養48h。單核細胞增生李斯特氏菌呈窄小的β-溶血環(huán)。
�。�7）在明亮的光照下，觀(guān)察經(jīng)穿刺的血瓊脂平板，單核細胞增生李斯特氏菌和西爾李斯特氏菌圍繞穿刺點(diǎn)產(chǎn)生較清晰的β-溶血環(huán)，英諾克李斯特氏菌不產(chǎn)生溶血現象，而綿羊李斯特氏菌產(chǎn)生界限明顯的較大溶血環(huán)，在此不要試圖進(jìn)行種間的區分，但要記錄下溶血反應的特征，CAMP試驗可區分它們間的溶血反應。
�。�8）硝酸鹽還原試驗（選做）。用TSBYE肉湯培養物接種于硝酸鹽肉湯中，35℃培養5天后，加入0.2mL試劑A，再加入0.2mL試劑B，混合，出現紫紅色為陽(yáng)性反應，表明硝酸鹽已被還原，如無(wú)顏色出現，在試管內再加入少量鋅粉，放置1h，如出現紫紅色，表明硝酸鹽仍存在，未被細菌還原。只有默氏李斯特氏菌還原硝酸鹽，因此，從格氏李斯特氏菌中區分出默氏李斯特氏菌就必須進(jìn)行這唯一的試驗。本試驗還有一等效試驗，即加入0.2mL試劑A后，再加入0.2mL試劑C，出現橙色表明硝酸鹽已被還原。如未出現顏色反應，也加入少量鋅粉，若出現橙色表明硝酸鹽未被還原。
�。�9）將TSBYE培養物穿刺到SIM和MTM試管中，室溫培養7天，每日觀(guān)察，李斯特氏菌呈典型傘狀生長(cháng)。在MTM中傘狀生長(cháng)更典型。同時(shí)，30℃的TSBYE培養物在油鏡下可見(jiàn)細菌作翻轉運動(dòng)。
�。�10）將TSAYE肉湯培養物分別接種于0.5%（W/V）葡萄糖、麥芽糖、七葉苷、甘露醇、鼠李糖、木糖發(fā)酵管內（可選用倒立發(fā)酵管），35℃培養7天，呈陽(yáng)性反應的李斯特氏菌產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，李斯特氏菌發(fā)酵鼠李糖和木糖的情況見(jiàn)下表。所有李斯特氏菌對葡萄糖、七葉苷、麥芽糖均能發(fā)酵，除格氏李斯特氏菌均不能發(fā)酵甘露醇。如果在OXA、PALCAM或加七葉苷/Fe3+的LPM分離平板上菌落色素很明顯，則七葉苷試驗可免做。
李斯特氏菌屬的區別
|
種別 |
溶血 |
硝酸鹽 |
糖發(fā)酵 | ||
|
甘露醇 |
鼠李糖 |
木糖 | |||
|
單增李斯特氏菌 |
+ |
- |
- |
+ |
- |
|
英諾克李斯特氏菌 |
- |
- |
- |
V |
- |
|
威爾斯李斯特氏菌 |
- |
- |
- |
V |
+ |
|
西爾李斯特氏菌 |
+ |
- |
- |
- |
+ |
|
格氏李斯特氏菌 |
- |
- |
+ |
V |
- |
|
綿羊李斯特氏菌 |
+ |
- |
- |
- |
+ |
V:反應不定
4、血清學(xué)鑒定
下表顯示了李斯特氏菌種間的血清學(xué)關(guān)系。
李斯特氏菌的血清學(xué)關(guān)系
|
種別 |
血清型 |
|
單增李斯特氏菌 |
1/2A、1/2B、1/2C、3A、3B、3C、4A、4AB、4B、4C、4D、4E、“7” |
|
綿羊李斯特氏菌 |
5 |
|
英諾克李斯特氏菌 |
4AB、6A、6B、Un（未確定） |
|
威爾李斯特氏菌 |
6A、6B |
|
西爾李斯特氏菌 |
1/2B、4C、4D、6B、Un（未確定） |
將TSBYE肉湯培養物接種到3mLTSBYE肉湯中，35℃培養24h，接種2支TSAYE瓊脂斜面，35℃培養24h。用3mL0.01mol/l磷酸鹽緩沖液將斜面菌苔洗下，菌懸液于80℃水浴中加熱1h，以2500r/min離心30，棄去2mL上清夜，將剩余液與沉淀混勻制成菌懸液，進(jìn)行血清學(xué)玻片凝集試驗。
5、小鼠毒力試驗
將分離的菌株接種到10 mL TSBYE肉湯中，35℃培養24h，將培養物離心、濃縮，用1mL生理鹽水制成菌懸液（濃度為1010個(gè)菌/mL），取0.1mL腹腔注射體重為16-18g 小鼠，每組5個(gè)觀(guān)察7d內小鼠死亡情況。用已知致病的單增李斯特氏菌和非致病的英諾克李斯特氏菌相同方法進(jìn)行，做對照試驗。
6、協(xié)同溶血（CAMP）試驗
在羊血瓊脂平板上平行接種β-溶血金黃色葡萄球菌（S.aureus）和馬紅球菌(R.equi),在它們中間垂直劃線(xiàn)接種可疑菌，與兩線(xiàn)相近但不相交，在30℃培養24h-48h,檢查平板中垂直接種點(diǎn)對溶血環(huán)的影響�？拷瘘S色葡萄球菌接種點(diǎn)的單增李斯特氏菌的溶血增強，西爾李斯特氏菌的溶血也增強，綿羊李斯特氏菌在馬紅血球附近的溶血增強。
（二）控制
單增李斯特氏菌在一般熱加工處理中能存活，熱處理已殺滅了競爭性細菌群，使單增李斯特氏菌在沒(méi)有競爭的環(huán)境條件下易于存活，所以在食品加工中，中心溫度必須達到70℃持續2分鐘以上。
單增李斯特氏菌在自然界中廣泛存在，所以即使產(chǎn)品已經(jīng)過(guò)熱加工處理充分滅活了單增李斯特氏菌，但有可能造成產(chǎn)品的二次污染，因此蒸煮后防止二次污染是極為重要的。
由于單增李斯特氏菌在4℃下仍然能生長(cháng)繁殖，所以未加熱的冰箱食品增加了食物中毒的危險。冰箱食品需加熱后再食用。
