大腸桿菌O157:H7的檢驗

1、培養基制備：

　　改良EC新生霉素增菌肉湯 （mEC）： EC肉湯滅菌后添加20mg/mL過(guò)濾除菌的新生霉素，使終濃度為20μg/mL。

　　改良山梨醇麥康凱瓊脂（TC-SMAC）：山梨醇麥康凱瓊脂加入過(guò)濾除菌的1%亞碲酸鉀溶液，使終濃度2.5mg/L，頭孢克污，使終濃度為0.05mg/L。
　　MUG-LST肉湯：LST肉湯中添加4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG），使終濃度為0.1g/L。

2、增菌培養

　　秤取25克樣品放入225mL mEC中，均質(zhì)。于41±1℃培養18-24小時(shí)。

3、分離

　　將mEC肉湯培養物10倍遞增稀釋。從10-4，10-5，10-6稀釋度，各取0.1mL涂布于TC-SMAC平板。于36±1℃培養18~24小時(shí)。

　　可疑 EHEC O157:H7菌落扁平，透明或半透明，邊緣光滑，呈淡褐色中心，直徑約2mm。

4、鑒定

　　挑取TC-SMAC上的可疑菌落，接種MUG-LST，于36±1℃培養18~24小時(shí)，出現產(chǎn)氣，且無(wú)熒光者，分離到普通營(yíng)養瓊脂。

　　對純菌落用EHEC O157:H7標準血清或膠乳凝集試劑作凝集試驗，必要時(shí)進(jìn)行生化試驗。

　　在檢測過(guò)程中，也可以在選擇性增菌后，取出5mL增菌液，經(jīng)100℃水浴15分鐘滅活后，供自動(dòng)酶聯(lián)熒光免疫測試（VIDAS），迅速獲得初步結果，陽(yáng)性反應者需作進(jìn)一步證實(shí)。

                              EHEC O157:H7檢驗程序圖解

檢樣25g

↓

　　　　　　mEC225mL → VIDAS快速篩選

　　↓41±1℃，18-24h

10^-4，10^-5，10^-6稀釋度涂布TC-SMAC

↓36±1℃，18-24h

挑取5-10個(gè)可疑菌落接種MUG-LST

↓36±1℃，18-24h

MUG陰性培養物轉種普通營(yíng)養瓊脂

↓ 　　　　↓

生化反應鑒定 　　　血清凝集鑒定

　　　　　　　或

　　　　　　　　　膠乳凝集試驗

　　用上述方法在樣品中分離獲得的純菌落，經(jīng)抗E.coli O157:H7標準血清或EHEC O157:H7膠乳凝集測試為陽(yáng)性者，報告檢出腸出血性大腸桿菌O157:H7。

　　如需要進(jìn)一步檢測Vero毒素基因的存在，可通過(guò)接種Vero細胞或Hela細胞，觀(guān)察細胞病變進(jìn)行判定，或可使用基因探針檢測和聚合酶鏈反應（PCR）檢測法。（參見(jiàn)FDA細菌分析手冊第8版）

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