啤酒酵母的計數

一、實(shí)驗目的：

    學(xué)習用血球計數板計數酵母數量的方法，

二、實(shí)驗原理：

    啤酒發(fā)酵時(shí)，必須接入一定數量的酵母細胞；在發(fā)酵過(guò)程中，為了跟蹤發(fā)酵的進(jìn)程，判斷發(fā)酵是否正常，也有必要測定懸浮酵母細胞的濃度。酵母菌的計數常用血球計數板方法。血球計數板是一塊長(cháng)方形的玻璃板，被四條凹槽分隔成三個(gè)部分，中間部分又被一橫槽隔成上下兩半，每一半上各刻有一個(gè)方格網(wǎng)，方格網(wǎng)的邊長(cháng)為3mm,分為9個(gè)正方形大格，每一大格為1mm²,其中中間那個(gè)大格被橫向和縱向的雙線(xiàn)分成25（或16）個(gè)中格，每個(gè)中格又被單線(xiàn)分成16（或25）個(gè)小格，因此一個(gè)大格中共有25×16=400個(gè)小格。這樣的一個(gè)大格就是一個(gè)計數室。由于計數室比板表面要低0.1mm,因此蓋上蓋玻片后，整個(gè)計數室的容積就是0.1 mm³,相當于0.0001mL。

    計數時(shí)，先讓計數室中充滿(mǎn)待檢溶液，然后計數400個(gè)小格中的細胞總數，就可換算出1mL發(fā)酵液中的總菌數。

三、實(shí)驗器材：

    顯微鏡，血球計數板，蓋玻片等。

四、實(shí)驗步驟：

1. 取清潔的血球計數板一塊，平放于桌面上，在計數室上方加蓋專(zhuān)用蓋玻片；

2. 取酵母菌液（發(fā)酵液）一小滴，滴至蓋玻片的邊緣，讓菌液滲入計數室內，注意計數室內不能留有氣泡。

3. 靜置5分鐘，讓酵母細胞穩定附著(zhù)于計數室內；

4. 將計數板置于顯微鏡的載物臺上，先用低倍鏡找到計數板的方格網(wǎng)，并移至視野中間（尋找時(shí)可通過(guò)縮小光圈，降低聚光鏡，開(kāi)低電源電壓等方式減少進(jìn)光量，使視野稍偏暗）；

5. 找到計數室位置（中間一個(gè)大方格），并看清由雙線(xiàn)包圍的中方格（16或25格）及由單線(xiàn)包圍的小方格（共400格）；

6. 計數大格內的酵母細胞總數，必要時(shí)可在高倍鏡下觀(guān)察。

   若酵母細胞過(guò)多，可采取

（1）：稀釋后再計數；

（2）：有代表性地選擇左上，左下，右上，右下，中間五個(gè)中方格，計數其內的菌數，求得每個(gè)中格的平均值，然后乘以中方格數（25或16），即得每個(gè)大格內的細胞總數；

（3）：在上述5個(gè)中方格中選擇處于頂角的4個(gè)小方格，計數，計算20個(gè)小方格中的總菌數，再乘以20，即得大格內的細胞總數。

7. 計算：

    酵母細胞數/mL=大格中的細胞總數×10000×稀釋倍數

8. 血球計數板的清洗：

   將血球計數板立即用流水沖洗干凈，若菌液變干，酵母細胞被固定在計數板上，則很難用流水沖洗干凈，必須用優(yōu)質(zhì)脫脂棉濕潤后輕輕擦洗，再用流水沖洗干凈，涼干

五、注意事項：

1. 血球計數板的計數室內刻度非常精細，清洗時(shí)切勿用試管刷或其它粗糙物品擦拭。

2. 加樣前，應先放好蓋玻片，讓菌液自然吸入。如果先加菌液，則由于蓋玻片較輕，可能會(huì )浮在菌液上，這樣，計數室內的容積就不再使0.0001mL了。因此，為了使結果更加準確，最好不要用普通的蓋玻片來(lái)替代。

3. 計數時(shí)，為避免重復或遺漏，對壓在方格線(xiàn)上的細胞，應遵循數上不數下，數左不數右的原則（即凡壓在上部或左面線(xiàn)上的細胞，都應計數入內，凡壓在下部或右面線(xiàn)上的菌體，都應忽略不計）。對出芽細胞，如果子細胞大于母細胞的一半，則應算作兩個(gè)細胞。

六、思考題：

  計數時(shí)，發(fā)現計數板不干凈，怎樣快速地清洗計數板？

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