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一、厭氧菌樣品的采集Collection of anaerobic bacteria' s specimens
標本避免正常菌群污染和氧接觸，采用下列方法。
(1) 膿胸及未破潰的膿腫：皮膚消毒后， 以無(wú)菌注射器抽取(排盡空針及針頭內的氣體) ，將針頭插入無(wú)菌橡皮塞內送檢。
(2) 肺分泌物和痰標本：用支氣刷采取或環(huán)甲膜穿刺術(shù)。
(3) 尿液標本：用元菌注射器從恥骨上緣行膀脫穿刺術(shù)抽取。
(4) 血液標本：可用兩端接有無(wú)菌針頭的塑料袋或橡皮導管，將一端針頭刺入靜脈，待血液流出后將另一端針頭立即插入培養瓶?jì)?/SPAN>(瓶?jì)蓉搲?/SPAN>) ，使血液直接流入培養瓶?jì)取?/SPAN>
(5) 竇道、深部膿腫等的標本:可用特別采樣器采取。
二、涂片與染色Smear preparation and stain
標本涂片、革蘭染色、鏡檢，觀(guān)察細菌的形態(tài)和染色性，并估計標本中大致的含菌量，可用"少量” " + "、" ++ "、" + ++"、" ++++ "表示。鏡檢不僅能反映各種厭氧菌的特殊形態(tài)，同時(shí)也能為鑒定厭氧菌提供參考和依據。如脆弱擬桿菌菌體細長(cháng)，兩端尖：韋榮球菌是極小的革蘭陰性球菌。厭氧菌芽胞的位置、形態(tài)、大小對鑒定很有意義，必要時(shí)作芽胞形成試驗。例如，芽胞在菌體極端且大于菌體呈鼓槌狀，是破傷風(fēng)梭菌的特征。根據慶氧菌的特殊形態(tài)，可初步確定有無(wú)厭氧菌感染，及時(shí)向臨床醫師發(fā)出一級報告，建議采用哪類(lèi)藥物。
三、標本接種Inoculating
一般標本接種3 個(gè)血瓊脂平板，分別放置于有氧、無(wú)氧和含5 %~ l0 % CO2 的環(huán)境中培養。如果只要求檢出厭氧菌，只需接種l 個(gè)慶氧血瓊脂平板，也可增加1 個(gè)相應的選擇慶氧血瓊脂平板。為便于在混合培養中及早發(fā)現慶氧菌，一般將標本分3 段劃線(xiàn)接種，在第1 和第2 段交界處貼1 張甲硝嘩(5 mg/片)紙片，若出現隱約抑菌圈，則提示有慶氧菌生長(cháng)。
不同慶氧菌的生長(cháng)速度和菌落形態(tài)各異，色素也有不同，熒光產(chǎn)生與否也有助于鑒定，根據上述特征，可初步推測厭氧菌的種類(lèi)。
1.革蘭陰性桿菌
(1)在BBE 瓊脂平板上有灰黑色、直徑> lmm 的菌落，菌落周?chē)泻谏臅�，可初步鑒定為脆弱擬桿菌。
(2) 在卡那萬(wàn)古溶血瓊脂平板上，有棕色或黑色菌落，或用伍德燈照射有磚紅色熒光者，為產(chǎn)黑素普雷沃菌。
(3)菌落沉入瓊脂內，使培養基表面留有小坑者，可能是解脲擬桿菌和纖細擬桿菌。
(4) 菌落表面有小斑點(diǎn)，或如面包屑，結合涂片所見(jiàn)，可初步鑒定為具核梭桿菌。
2. 革蘭陰性球菌 菌體很小，排列成雙、短鏈或小堆，菌落小，不透明，可能是小韋榮球菌。
3. 革蘭陽(yáng)性球菌排列成長(cháng)短不等的鏈，可能是消化鏈球菌。
4. 蘋(píng)蘭陽(yáng)性無(wú)芽胞桿菌
(1)菌落呈臼齒形、粗糙，結核膿樣分泌物中有硫黃樣顆粒，可能是放線(xiàn)菌。
(2) 菌體呈X 、Y 、V 排列，菌落小，灰白，不透明，可能是丙酸桿菌。
5 . 革蘭陽(yáng)性芽胞桿菌 只要見(jiàn)有芽胞，即可鑒定為梭菌屬。菌落有雙環(huán)溶血，卵黃平皿上卵磷脂酶試驗和Nagler 試驗陽(yáng)性，涂片染色為革蘭陽(yáng)性短粗桿菌，有芽胞，有莢膜，可鑒定為產(chǎn)氣莢膜梭菌。
四、耐氧試驗Oxygen tolerance test
當慶氧平板上有細菌生長(cháng)時(shí)，為了確定是否為厭氧菌，必須做耐氧試驗。從每個(gè)瓊脂平板上挑取4~5 個(gè)性狀不同的菌落，每個(gè)菌落分別轉種于2 塊需氧血瓊脂平板和1 塊厭氧血瓊脂平板(每個(gè)瓊脂平板可劃4~6 區，每區種一個(gè)可疑菌落) ，然后將平板分別放置在需氧、二氧化碳和厭氧環(huán)境中培養。
凡在厭氧環(huán)境生長(cháng)，而在需氧和二氧化碳環(huán)境中不生長(cháng)的細菌為專(zhuān)性慶氧菌(圖3 - 48 中A 區) ;在需氧和厭氧環(huán)境中均能生長(cháng)者為兼性厭氧菌(圖3 - 48 中B 區) ;在需氧和二氧化碳環(huán)境中生長(cháng)，而在厭氧環(huán)境中不生長(cháng)者為專(zhuān)性需氧菌(圖3 - 48 中C 區) ;在需氧、厭氧環(huán)境中均不生長(cháng)或生長(cháng)不佳，而在二氧化碳環(huán)境中生長(cháng)良好的細菌為需二氧化碳菌(圖3 - 48 中D 區) 。
五、鑒定試驗Identification test
可依據厭氧菌的菌體染色形態(tài)、菌落特性以及對某些抗生素的敏感性作出初步鑒定。最后鑒定則要進(jìn)行生化反應及終末代謝產(chǎn)物等檢查。
生化試驗主要包括多種糖類(lèi)發(fā)酵試驗、吲哚試驗、硝酸鹽還原試驗、觸酶試驗、卵磷脂酶試驗、脂酶試驗、明膠液化試驗及膽汁肉湯生長(cháng)試驗和硫化氫試驗等。目前用于厭氧菌快速鑒定有胞外酶試驗， 4 h 即可觀(guān)察結果;自動(dòng)微生物鑒定系統，如VITEK-ANI 、MicroScan- ANI 等也可鑒定慶氧細菌。
在進(jìn)行慶氧菌分離鑒定的過(guò)程中，需注意下列事項: ①厭氧菌標本在采集和運輸的過(guò)程中必須與空氣隔絕(厭氧菌暴露于空氣中時(shí)間太長(cháng)可死亡) ，務(wù)必在30 min 內完成，同時(shí)應避免正常菌群的污染。②培養基要新鮮配制，若儲存太久，有氧氣溶解在表面或有過(guò)氧化物在培養基中，不利于慶氧菌生長(cháng)。③ 若菌落太小，需用放大鏡觀(guān)察菌落。④作耐氧試驗，要求從每個(gè)瓊脂平板上挑取4 ~ 5 個(gè)性狀不同的菌落，分別接種需氧和厭氧血瓊脂平板，置于需氧、二氧化碳和厭氧環(huán)境中培養。⑤ 如作胞外酶鑒定， 一定要有足夠的菌液濃度。
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