植物病毒的Northernblot分析

一、目的
    Northernblot分析是將提取的樣品RNA先通過(guò)變性瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離后，將RNA轉移到尼龍膜或硝酸纖維素膜上，然后在通過(guò)雜交分析RNA的數量和大小。比點(diǎn)雜交有更高的特異性�？捎糜诓《救笔�突變體及轉病毒基因植物轉錄水平分析。
    采用地高辛（digoxigenin ）標記標記探針，克服了同位素探針的不足，并且其檢測靈敏度已接近放射性同位素的水平。Dig-11-dUTP是由類(lèi)固醇半抗原dig與dUTPC11位結合形成，可用直接結合有熒光色素或酶的抗地高辛配基抗體或間接使用免疫熒光法進(jìn)行檢測。采用這一方法標記病毒特異片段作為探針，可以長(cháng)期保存使用方便。

二.實(shí)驗材料和用具

1.作為模板用的病毒基因片段，待檢大田樣品，已知病株或病毒。
2.試劑
    地高辛核酸探針標記和檢測試劑盒：BoehringerMannheim 公司, 甲酰胺和甲醛,10XMOPSbuffer(200MmMOPS,50MmNaAc,10MmEDTA,Ph7.0),1.2%變性瓊脂糖凝膠(100ml:1.2g,10mL10XMOPSbuffer,加水到74,加熱溶解,冷至70后,加入16甲醛,混勻后迅速倒膠)。
    尼龍膜,電泳設備，雜交爐等。

三.實(shí)驗步驟

1.地高辛標記病毒cDNA探針：按公司產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
2.樣品RNA的分離
3.變性瓊脂糖凝膠電泳：樣品混合液（1XMOPS，50% 甲酰胺，6% 甲醛）上樣、電泳。
4.轉膜：尼龍膜用2XSSC溶液濕潤均勻，利用10XSSC緩沖液毛細管吸引作用或真空轉移法將RNA轉到膜上。轉膜后將膜侵入6XSSC5分鐘，晾干置80℃烘烤2小時(shí)。
5.預雜交、雜交和洗膜同前述方法。

6.免疫檢測：按公司產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

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