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一、目的
采用光敏生物素作光照標記則可以避免以上不足，本實(shí)驗利用長(cháng)臂光敏生物素標記，由于克服了空間位阻，使檢測靈敏度成百倍地提高(其靈敏度已接近放射性同位素的水平)。
用長(cháng)臂光敏生物素標記的核酸探針與固定在硝酸纖維膜(NC膜)上的樣品核酸分子進(jìn)行斑點(diǎn)雜交，洗凈后用抗生物素-堿性磷酸酶復合物(AV-AP)作酶標，與底物BCIP+NBT顯色反應，即可觀(guān)察檢測結果。本實(shí)驗目的即采用這一方法標記病毒特異片段作為探針，以期在核酸分子水平上檢測特定的病毒。
二.實(shí)驗材料和用具
1.材料
作為模板用的病毒外殼蛋白基因DNA片段，待測大田樣品，陽(yáng)性株、病毒或質(zhì)粒。
2.試劑
長(cháng)臂光敏生物素核酸探針標記和檢測試劑盒：購自華美生物制品公司(軍事醫學(xué)科學(xué)院放射醫學(xué)研究所生產(chǎn))
硝酸纖維素膜(NC膜)：Bio-rad公司產(chǎn)品，產(chǎn)品號162-0116
甲酰胺：Fluka公司產(chǎn)品
牛血清白蛋白(BSA)：北京紅星生物化學(xué)制品廠(chǎng)產(chǎn)品
普通化學(xué)藥品由國內各化學(xué)試劑廠(chǎng)生產(chǎn)
三.實(shí)驗步驟
1.光敏生物素標記GFV-cDNA探針于暗室中，將制備的待標記病毒-cDNA(0.5-1.0ug/ul，無(wú)用Tris溶解)定量加入小離心管中，加入等體積至倍量的光敏生物素溶液(1 μl/ μl)，充分混勻。將小離心管插入冰浴盒中，開(kāi)啟光標記燈(250W汞燈)燈頭距液面10cm，光照20-25min。光標完畢，反應液為紅褐色，加dH2O至總體積為100 μl ，加入100 μl仲丁醇，振蕩混勻，離心1min，小心吸去上層丁醇相，再如上重復加仲丁醇萃取一次，吸去仲丁醇。仲丁醇提取2次后，水相體積應減少至40 μl，水相呈淡紅色。在此液中，加入5 μl3MNaAc充分混勻，加100 μl冷無(wú)水乙醇，置于-20℃過(guò)夜。4℃離心15min。棄上清，用冷80%乙醇洗一次。沉淀真空干燥。沉淀溶于少量ddH2O，配制成母液。-20℃保存，用時(shí)稀釋。
2.核酸斑點(diǎn)雜交
樣品的制備：參見(jiàn)前面關(guān)于病毒RNA、總RNA的提取。樣品在斑點(diǎn)雜交前先經(jīng)熱變性處理。
膜的處理：NC膜用2XSSC溶液濕潤均勻，放在濾紙上，37℃晾干。
點(diǎn)樣：用Tip頭吸取樣液1-5 μl ，分多次點(diǎn)樣于NC膜上一點(diǎn)，使斑點(diǎn)盡可能的小，同時(shí)NC膜上要作記號。
烘干：放于一鋪有潔凈濾紙的培養皿中，80℃烘烤2小時(shí)。
配備預雜交液和雜交液：(每cm2 膜用80 μl的量，以下為5 ×10cm2用4ml)。
3：用前煮沸10min變性，速置冰水中冷卻，再加入。
預雜交：將雜交條放入小管中,加入預雜交液2ml,42℃搖動(dòng)2-4h。
雜交：將雜交條換入另一小管中,加入雜交液2ml,42℃搖動(dòng)20-24h。
洗滌：將膜取出，放入平皿中，用雜交洗滌液A ：2 ×SSC，加0.1%SDS洗三次，每次5min，室溫加振蕩。
將膜放于三角瓶中，用雜交洗滌液B ：0.1 ×SSC，加0.1%SDS65℃振蕩洗三次，每次5min。輕輕吸干濾膜，放入另一皿中，準備顯色。
4.顯色
封閉：用2ml3%BSA封閉液(3gBSA溶于70mldH2O中，用濃HCl調pH至3.0，煮沸20min 后，冷至室溫，用 10mMNaOH 調pH 至7.5 ，加入10ml 緩沖液： 1MTris- HClpH7.520mMMgCl2 ，0.05%(V/V)TritonX-100 ，5.8gNaCl 。加水至100ml)，42 ℃封閉2-4h 以上(封閉液在4℃保存可重復使用3次,5 ×10cm2膜使用4ml)。
酶聯(lián)：將膜取出，放入2ml抗生物素蛋白AV與AP酶偶聯(lián)復合體溶液中，室溫避光保溫15min ，輕輕振蕩。AV-AP 液：緩沖液：100mMTris-ClpH7.5 ，1.0MNaCl ，2mMMgCl2，0.05%(V/V)TritonX-100。4ml緩沖液內加入AV-AP8-16U，適合5 ×10cm2膜的用量。AV-AP溶液在4℃保存可反復使用多次。
洗滌：用洗滌液A ，B 各洗三次，每次5min 。顯色洗滌液A ：100mMTris-ClpH7.5,1.0MNaCl,2mMMgCl2 ，0.05%(V/V)TritonX-100 。顯色洗滌液B:0.1mMTris-ClpH7.5，0.5MNaCl，0.5%Tween-20。
顯色：將膜放入另一管子中，加入新配制的底物溶液2ml ，再加入BCIP(1)10 μl，NBT(2)10 μl，避光放置。顯色數分鐘至數小時(shí)。陽(yáng)性結果為出現蘭紫色斑點(diǎn)。本底未出現前即可傾出顯色液終止。
底物溶液：100mMTris-ClpH9.5,100mMNaCl,5mMMgCl2 。(1)BCIP10mg溶于200 μl 甲酰胺中。(2)NBT15mg溶于200 μl70% 甲酰胺中。此二液均可在-20℃保存。
終止反應：用終止液(10mMTris-ClpH7.5，1.0mMEDTA)洗一次，dH2O沖洗凈，封存于聚乙烯袋中，避光保存。選擇膜濕潤狀態(tài)拍攝結果。
