海博微信公眾號
海博天貓旗艦店
海博微信公眾號
海博天貓旗艦店
一．目的
負染方法是在分子水平上闡明病毒質(zhì)粒細微結構的一種常用方法，在電鏡生物樣品制備中以快速、簡(jiǎn)便、用量少和反差大效果好而成為一項普遍應用的重要方法。通過(guò)幾種負染法的實(shí)驗，初步掌握病毒病的快速診斷方法。
二．基本原理
高密度重金屬鹽類(lèi)染色劑對蛋白質(zhì)不能染色，因此可在病毒粒子周?chē)谋尘疤幊练e下來(lái)，造成很強的電子散射而形成較暗的背景，病毒粒體易被電子束穿透成為亮的物體，如同照片的底片（負片）一樣，這種染色方法被稱(chēng)為負染。
三．主要儀器、用具及藥劑
儀器：電鏡、超凈工作臺、溫箱、冰箱、萬(wàn)分之一天平、酸度計、顯微鏡。
藥劑：磷鎢酸、醋酸雙氧鈾、戊二醛、冰乙酸、聚乙烯醇縮甲醛(Formvar)、氯仿（三氯甲烷）、無(wú)水乙醇、雙蒸水。
用具：載玻片、工具盒,銅網(wǎng)、鑷子、單面刀片、手術(shù)剪、滴管、Parafilm膜、蠟片、培養皿、濾紙,小燒杯，白瓷盤(pán)、滴瓶及蒸溜水、圓頭玻棒、250 目銅網(wǎng)、平底皿、卡片紙、5ml量筒、玻璃條、鉛筆。
三．實(shí)驗材料
提純的煙草花葉病毒(TMV)、黃瓜花葉病毒(CMV)或其它提純病毒，病毒侵染的病葉
四．實(shí)驗步驟
（一）.提純病毒的負染色
第一種方法：
1.將提純的ＴＭＶ懸液用蒸餾水進(jìn)行1：10或1：100的稀釋?zhuān)?
2.用鑷子夾持銅網(wǎng)，滴管吸取樣品加在銅網(wǎng)上，稍待片刻，用濾紙片從銅網(wǎng)邊緣吸掉余液；
3.待銅網(wǎng)上的液體將干未干時(shí)，立即滴一滴2-3 ％磷鎢酸負染色液，注意不能使銅網(wǎng)背面粘上液體。1～2分鐘后，用濾紙吸掉余液，自然干燥；
o
4.將染好的銅網(wǎng)放在培養皿中，作好記錄，37 C溫箱中干燥0.5～1小時(shí)即可進(jìn)行電鏡觀(guān)察。
第二種方法：
1.將提純的CMV懸液與1％戊二醛固定液按10：1比例在蠟片上混合（戊二醛最終濃度為0.1％)，固定10～15分鐘；
2.用鑷子夾持銅網(wǎng)，沾取樣品懸液，稍待片刻；
3.用滴管吸取雙蒸水，連續洗滴銅網(wǎng)，洗掉戊二醛固定液等，清洗完畢后用濾紙吸掉余液。
4.待銅網(wǎng)上液體將干未干時(shí)，漂浮在1％醋酸鈾或3 ％磷鎢酸負染色液滴上，1～2分鐘后取出銅網(wǎng)，用濾紙吸掉余液。
5.將染好的銅網(wǎng)放在培養皿中，37 ℃溫箱中干燥0.5～1小時(shí)即可。
（二).植物病毒浸出法負染色
第一種方法：
1.在載玻片上滴一滴雙蒸水或0 ·005M磷酸緩沖液；
2.將一小片植物病葉放置于液滴中并用刀片切碎，讓病毒釋放到液滴中；
3.夾持銅網(wǎng)，沾取浸出液，稍待片刻，用濾紙吸掉余液；
4.再如上述相同方法進(jìn)行染色。
第二種方法：
1.將凹玻片中加幾滴雙蒸水或2 ％磷鎢酸負染色液；
2.取一小片植物病組織剪碎并在液滴中充分研細；
3.吸液滴到載玻片；
4.用鑷子夾持銅網(wǎng)倒扣到載片玻璃上，然后按上述相同方法進(jìn)行染色。若浸出液中植物殘渣過(guò)多，可先用雙蒸水對銅網(wǎng)滴洗后再進(jìn)行負染色。也可將組織浸出液經(jīng)低速離心（2000～4000rpm)后，沾取上清液進(jìn)行染色。）
第三種方法：
1.在取材前一天，將供試材料澆足水分。取材時(shí)選有代表性的病葉剪下，將幾張病葉重疊到一起，一手捏緊，另一手持鋒利刀片，將幾張葉片同時(shí)割破，此時(shí)破口處將有汁液滲出。
2.用尖細鑷子夾住帶膜銅網(wǎng)，使膜面朝向破口處，輕輕沾取汁液至銅網(wǎng)上
3.待銅網(wǎng)汁液將干未干時(shí)，將吸取負染液的毛細管呈45o角插入鑷子兩臂的間隙中間，輕而慢地滴加負染液。使染液經(jīng)過(guò)帶膜銅網(wǎng)上而隨即流逝。
4.待銅網(wǎng)上染液停留3～5分鐘，吸去余液。
5.37℃溫箱中干燥0.5～1小時(shí)后電鏡觀(guān)察。
上一篇：植物病毒抗血清的制備
