植物病毒抗血清的制備

一.目的

    制備植物病毒抗血清是用提純病毒作為抗原，注射兔子后刺激產(chǎn)生免疫反應，形成抗體的過(guò)程。分為抗原準備、免疫注射和抗血清的采集三部分。本實(shí)驗介紹常用方法，要求能基本掌握并獲得抗血清。

二.實(shí)驗材料和用具

   １.提純病毒懸浮液、３公斤公兔、高壓滅菌鍋、磁力攪拌器；
   ２.醫用羊毛脂、石蠟油、70％乙醇、二甲苯、NaN3、凡士林。 

   ３.用具：注射器、注射針頭、小燒杯、三角瓶、透析袋、刀片、脫脂棉、青霉素小瓶、轉子。

三.操作程序和方法

   １.處理提純病毒懸浮液：如用精提純病毒，濃度為1mg/ml，如保存病毒時(shí)所用緩沖液濃度高或含有其他高滲透壓物質(zhì)如尿素等，則可用pH7.2 的0.01M磷酸緩沖液透析三次（其中－次必須過(guò)夜），如病毒懸浮液中加過(guò)NaN3，則必須延長(cháng)透析時(shí)間和增加次數。
   ２.制備Freund's不完全佐劑：在小燒杯中放入1.5g羊毛脂和8ml石蠟油，在溫水浴中化開(kāi)，磁力攪拌器上混勻后經(jīng)高壓滅菌后4℃下保存備用。
   ３.將佐劑倒入小燒杯中，在磁力攪拌下按1：1量逐滴加入病毒懸浮液，充分攪拌至乳化完全，病毒液1mg/ml含量每次用2-5mg 。(將病毒懸浮液和佐劑在小燒杯中１：１等量混合，用注射器和針頭反復推吸以使乳化完全也可)。檢測乳化程度時(shí)可滴一滴乳化液至水面，如很快散開(kāi)則乳化不完全，須繼續乳化；如能持續片刻不散開(kāi)則為乳化完全。
   ４.兔子以個(gè)大(2-3公斤)、健康、未經(jīng)免疫的白兔為好，選用公兔或未交配過(guò)的母兔均可。
   ５.免疫：根據不同病毒的穩定性和免疫原性，可有多種注射方法與不同間隔的方案，本實(shí)驗采用肌肉注射。
    在兔子后腿外或內側肌肉上選肥厚處，剪毛后，用70 ％乙醇消毒、以9號針頭注入病毒-佐劑乳化液，進(jìn)針約深2cm。注射劑量視其具體情況而定。本實(shí)驗免疫具體設計
如下：
    第一周：(1).耳靜脈取血，制備少量正常血清；
    (2).肌肉注射乳化病毒2/3量，皮下三點(diǎn)注射1/3量。
    第二周：肌肉、皮下注射，用量如上。
    第三周：肌肉、皮下注射，用量如上。
    第六～七周：取血，測效價(jià)，效價(jià)最高時(shí)放血，制備抗血清。
   ６.采血：采血方法主要有靜脈采血、頸動(dòng)脈采血、心臟采血等。采血所用器具要
經(jīng)嚴格消毒。采血前免疫兔要給水、停食12-24小時(shí)。本實(shí)驗耳靜脈采血，步驟如下：
     (1).將免疫兔裝入固定箱中，使頭和耳全部露出。人工固定亦可。
     (2).耳背外緣靜脈處刮毛、用酒精將采血耳邊緣里、外兩面消毒。 

     (3).耳中部用蘸有二甲苯的脫脂棉涂擦，使耳血管充血，血流加速，其上涂一層凡士林。
     (4).在耳緣已擴張血管端部，用刀片尖順血管方向縱向劃破1-2毫米的切口(此后再采血時(shí)，切口位置自端部向耳基部移動(dòng))。適度時(shí)，血液隨即流出，血液收集在滅菌小燒杯中，每次取血20-40ml。不要讓血液接觸酒精，以免發(fā)生溶血現象。
     (5).切口部位用干藥棉壓迫止血，并擦凈兔耳上殘留血跡，防止兔子抓撓造成流血或感染。
     (6).可連續多次采血，每次間隔3-4天。如效價(jià)下降，可再次注射適量抗原，以維持更長(cháng)采血時(shí)間，采血期間，加強動(dòng)物的營(yíng)養。
   ７.血清的析出及保存。
     (1).將收集血液置室溫下凝固后，蓋好置37℃溫箱1-2小時(shí)。
     (2).用解剖刀沿燒杯邊緣輕輕剝離凝血塊。
     (3).蓋好置4℃冰箱過(guò)夜。
     (4).吸出析出血清，在3000rpm下離心10分鐘。
     (5).上清液即為無(wú)紅血球的澄清抗血清，按1/5000的量加入硫柳汞或1/1000量加入NaN3防腐。無(wú)菌分裝后密封-20℃保存。

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