紫外分光光度法測定提純病毒的濃度

一、目的

     由核蛋白組成的病毒有特有的紫外吸收峰，通過(guò)紫外分光光度計使用，掌握其測定原理、操作方法及病毒純度與定量的方法。

二、主要儀器、用具及藥劑

    紫外分光光度計、石英比色皿、移液管、吸管、試管、緩沖液、鏡頭紙。

三、實(shí)驗材料

    TMV或CMV等病毒提純樣品懸浮液。

四、實(shí)驗步驟

   １．準備好提純品及參比溶液，倒入石英比色杯。
   ２．打開(kāi)穩壓電源及751分光光度計，將比色杯裝入樣品槽。
   ３．按附錄操作程序使用紫外光測量樣品在波長(cháng)260nm及280nm處的光吸收值(以A或OD值表示)記錄數值。
   ４．每種病毒的蛋白與核酸含量有固定比例( 附表) ，用本次試驗吸收光譜比值(A260/A280)與標準比值比較。

   ５．用A260值計算病毒的濃度及產(chǎn)量。
  病毒濃度(mg/ml)=A260X稀釋倍數／E0.1%1cm260nm，

    E為消光系數，即在波長(cháng)260nm時(shí)，濃度為0 ·1％(1mg/ml)的懸浮液，光程為1cm時(shí)的光(光密度)吸收值。對已知病毒可以從附表中查到；對未知病毒要想定量病毒，先把病毒純品干燥稱(chēng)重，配成已知濃度的病毒懸液，在260nm下測其光密度，并折算成E0.1% 1cm。

    病毒產(chǎn)量(mg/kg)＝濃度X提純總ml數X1000/組織重(g)
[注意：測量時(shí)所用測量杯的寬度應是1cm，若杯寬為0.5cm，則所得光密度值應乘以2] 。由于光散射的影響，所測定的光密度大于病毒實(shí)際上的吸收光密度，因而存在誤差。因此，準確測定常常對測定的光密度進(jìn)行校正(見(jiàn)附錄)。

附表：幾種植物病毒的消光系數(E值)和A260/A280值

     病毒種類(lèi)                          E0.1%1cm260nm       A260/A280

                (TMV)              3  1                1  19
     煙草花葉病毒                         ·                   ·
                (CMV)              5  0                1 65
     黃瓜花葉病毒                         ·                   ·
                   (TYMV)          9  6                1 51
     蕪青黃色花葉病毒                       ·                   ·
          Y    (PVY)               2  8                1 28
     馬鈴薯 病毒                         ·                   ·
          X    (PVX)               2  97               1  19
     馬鈴薯 病毒                         ·                   ·
                (TNV)              5  6                1 70
     煙草壞死病毒                         ·                   ·
                (TRV)              3  0                1 88
     煙草脆裂病毒                         ·                   ·
                (TEV)              2  4                1 27
     煙草蝕紋病毒                         ·                   ·
                (TRSV)             12 8
     煙草環(huán)斑病毒                          ·
          S    (PVS)               3  0
     馬鈴薯 病毒                         ·

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