直接提取病毒侵染病株中dsRNA

一. 目的

植物ssRNA病毒在在植物體內增殖中，通過(guò)核酸互補而形成一種堿基配對的dsRNA，還有一些病毒核酸是dsRNA 。這類(lèi)雙鏈核酸在健康植物體內一般是不存在的。因此，檢測dsRNA的存在可以達到診斷病毒侵染的目的，并根據不同病毒的dsRNA 電泳圖譜的差異來(lái)區分不同的病毒。該方法易行、快速、操作簡(jiǎn)單、不需要昂貴的儀器。分離出來(lái)dsRNA還可用于RT-PCR、核酸雜交和cDNA合成。

二 實(shí)驗材料

     TMV、CMV或其它病毒等侵染的新鮮或冰凍葉片。

三.實(shí)驗用儀器及藥劑

     高速離心機，真空干燥儀，微量移液器，50mL和1.5mL離心管，磁力攪拌器

CF-11 纖維素（Whatman ），10XSTE緩沖液(0.5MTris-HClPh6.8 ，1MNaCl ，10mMEDTA) ， 10%SDS ， 純 化 皂 土 ， 飽 和 苯 酚 ， 氯 仿/ 異 戊 醇 (24∶1) ， 3MNaAc(pH5.2)，100%和70%的乙醇，滅菌蒸餾水。

四.實(shí)驗步驟

程序（一）：

  1.取適量病毒侵染病葉(5-7克)于研缽內，加液氮研磨成細粉末，倒入三角瓶中 
  2.融化后加入2倍的2XSTE抽提緩沖液（W/V ）、10%SDS至終濃度為1XSTE和2%的SDS，必要時(shí)加純化皂土
  3.加等體積飽和苯酚，置搖床或磁力攪拌器上振蕩混合30-60分鐘
  4.8000rpm，離心20分鐘
  5.取上清，加等體積氯仿，混合抽提10分鐘（此步可略去）
  6.10000rpm，離心10分鐘
  7.取上清水相，加無(wú)水乙醇至終濃度為15-18%，加2~3%（V/W ）的CF11，攪拌30分鐘
  8.12000rpm，離心3-5分鐘,棄上清
  9.沉淀加入1XSTE  （含16%乙醇），振蕩1-5分鐘 
  10.12000rpm，離心3-5分鐘,棄上清 
  11.重復9.10步驟2-3次 
  12.沉淀加入5mL1XSTE,振蕩懸浮1分鐘 
  13.12000rpm，離心3-5分鐘,取上清 
  14.重復12.13步驟1次，合并上清 
  15.加1/10體積3MNaAc，2.5倍體積冷無(wú)水乙醇，混勻、置-20℃下2小時(shí)以上 
  16.12000rpm，離心15分鐘，沉淀用70%乙醇洗兩次 
  17.真空干燥,3～5分鐘 
  18.沉淀溶于適量滅菌重蒸餾水或STE中,-20℃保存

程序（二）：

  7.取上清水相，加無(wú)水乙醇至終濃度為15-18%，

  8.稱(chēng)取2.5gCF11，加入30Ml1XSTE/16%乙醇，制備纖維素柱
  9.將樣品液加在柱子頂部過(guò)柱 
  10.用1XSTE  （含16%乙醇）100-120mL充分洗柱 
  11.用5mL1XSTE洗脫第1次，棄掉洗脫液 
  12.用5mL1XSTE洗脫第2次，收集洗脫液 
  13.再用5mL1XSTE洗脫第3次，收集洗脫液 
  14.合并后兩次收集的洗脫液
  其余步驟同程序（一）。

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