直接提取病毒侵染病株總RNA

一. 目的

     在植物病毒研究中,有時(shí)很難或不必要先提純病毒后再分離病毒RNA，而是直接將病葉中包括病毒RNA在內的植物總RNA大分子分離出來(lái)，獲得的總RNA可用于RT- PCR 、點(diǎn)雜交、northern雜交和分離植物抗病基因差異表達的cDNA 的方法（DDRT- PCR ）。本實(shí)驗學(xué)習用酚-SDS-LiCl法提取病毒RNA。

二.實(shí)驗材料

     TMV、CMV或其它病毒等侵染的新鮮或冰凍葉片。

三.實(shí)驗用儀器及藥劑

     高速離心機，真空干燥儀，微量取樣器，1.5mL離心管
     抽取緩沖液(20mMTris-HClpH8.0；1%SDS；200mMNaCl；5mMEDTA)
     飽和苯酚/氯仿(1  ∶1)，氯仿/異戊醇(24  ∶1)，4MLiCl，70%的乙醇，DEPC處理后滅菌蒸餾水。

四.實(shí)驗步驟

  1.取適量病毒侵染病葉于研缽內，加液氮，將材料研磨成極細粉末，取300-500mg粉末放入1.5mL離心管中，
  2.加入加300-500 μl抽提緩沖液
  3.加等體積飽和苯酚/氯仿(400 μl)，輕微振蕩混合2-5分鐘
  4.12000rpm離心5分鐘
  5.取上清水相，再加等體積飽和苯酚/氯仿，混合抽提
  6.12000rpm離心2分鐘
  7.加等體積氯仿/異戊醇(24  ∶1)抽提一次
  8.取上清水相，加等體積冷4MLiCl，混勻、置4℃下3小時(shí)以上
  9.12000rpm離心15分鐘 
  10.倒去上清,沉淀用70%冷乙醇(0.5ml)洗滌3次 
  11.真空干燥,3～5分鐘 
  12.沉淀溶于20 μl滅菌重蒸餾水中,-20℃保存

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