植物病毒血清學(xué)檢測—酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(ELISA):(Fab')-ELISA

二.實(shí)驗材料和用具

   1.專(zhuān)化性抗體免疫球蛋白IgG(濃度約為1mg/ml)

   2.系統感染病毒的植株和健康植株

   3.酶標記羊抗兔抗體球蛋白IgG(市售)或A蛋白標記的堿性磷酸酯酶(Sigma產(chǎn)品)。

   4.酶聯(lián)板、微量加樣器、洗瓶、酶聯(lián)讀數儀

   5.抗原包被緩沖液、洗滌緩沖液、IgG稀釋緩沖液、底物溶液

三.實(shí)驗步驟

   1.配制緩沖液
    (1).抗原包被緩沖液(0.05M碳酸鹽緩沖液，pH9.6)
    Na2C031.59g；NaHCO32.93g；NaN30.2g蒸餾水加至1升。

    (2).洗滌緩沖液(0.02MPBS-吐溫緩沖液，PBS-T，pH7.4)
    NaCl8.0g ；Na2HPO4 '12H2O2.9g；KH2PO4 0.2g； 
    KCl0.2g；NaN30.2g；蒸餾水加至1升后加Tween-200.5ml.

    (3).IgG稀釋緩沖液(0.02MPBS-T，牛血清白蛋白溶液)
    取0.1g牛血清白蛋白溶于用滅菌蒸餾水配制的PBS-T緩沖液100ml中即成。
    (4).底物溶液(鄰苯二胺溶液)
    a液：檸檬酸19.2克加水溶至1000ml為0.1M檸檬酸溶液
    b液：Na2HPO4.12H2O71.6g加水溶至1000ml為0.2MNa2HPO4溶液。 
    取a液24.3ml加b液25.7ml混合即成磷酸鹽-檸檬酸緩沖液pH5.0 。
    稱(chēng)取40mg 鄰苯二胺，溶解后過(guò)濾，加上述緩沖液至100ml ，臨用前加30 ％H2O2 0.15ml即成(注意鄰苯二胺也需新鮮配制)。

    (5).堿性磷酸脂酶底物緩沖液：
二乙醇胺緩沖液：二乙醇胺97ml，蒸餾水800ml，混合，用濃HCl調pH=9.8 ，加水至1000ml。取硝基酚磷酸pNPP60mg溶于100ml上述二乙醇胺緩沖液中，即為底物緩沖液(現配現用，時(shí)間長(cháng)了會(huì )變色)。
    堿性磷酸脂酶標記的A蛋白(Sigma產(chǎn)品)，溶于1.0ml50%甘油中即可使用。 
    2.取顯癥葉片和健康葉片用抗原包被緩沖液分別配制1 ∶10，1 ∶100，1 ∶1000 樣品懸浮液，過(guò)濾或低速離心后備用。
    3.按設計(同實(shí)驗三)在酶聯(lián)板上加樣，每孔200 μl，(Fab')2 以1/2000-4000的比例稀釋在50mM包被緩沖液(pH9.6)中；在30℃下孵育四小時(shí)，或4℃過(guò)夜(時(shí)間長(cháng)，包被好)；
    4.洗板三次同實(shí)驗三；
    5.樣品稀釋在提取緩沖液中，4℃下孵育過(guò)夜；洗板同前；
    6.IgG(可用未純化的抗血清) 以1/2000-4000的比例稀釋在提取緩沖液中，30℃孵育三小時(shí)，洗板同前；
    7.酶標A蛋白以1/2500比例稀釋在提取緩沖液中，30℃孵育三小時(shí)，洗板同前；
    8.加底物，室溫孵育不超過(guò)30分鐘(過(guò)氧化物酶)，2-4小時(shí)(堿性磷酸酯酶)，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定結果。