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一. 目的
酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)是將抗原和抗體包被在固相支持物上，使免疫反應在固體表面進(jìn)行，并借助與反應的抗體上所標記的酶和底物生成的有色產(chǎn)物進(jìn)行檢測。酶聯(lián)法有多種形式，本實(shí)驗介紹最簡(jiǎn)便和常用的間接法。
二.實(shí)驗材料和用具
1.專(zhuān)化性抗體免疫球蛋白IgG(濃度約為1mg/ml)
2.系統感染病毒的植株和健康植株
3.酶標記羊抗兔抗體球蛋白IgG(市售)
4.40孔或96孔酶聯(lián)板
5.酶聯(lián)免疫檢測儀。臺式離心機。冰箱。
6.微量取液器(40－200 μl可調，1000ul可調，20ul可調）；洗瓶。
7.包被緩沖液；洗滌緩沖液；IgG稀釋緩沖液；底物溶液；鄰苯二胺(OPD）；過(guò)氧化氫（H2O2 ）；2M硫酸。
8.10ml、200ml量筒；5ml 、10ml、100ml、500ml燒杯；50ml三角瓶；100ml、500ml容量瓶；研缽；記號筆；小塑料袋；2-5ml可調洗滌瓶。
三. 配制緩沖液
(1)抗原包被緩沖液(0.05M碳酸鹽緩沖液，pH9.6)
Na2C031.59g；NaHCO32.93g；NaN30.2g，蒸餾水加至1升。
(2).洗滌緩沖液(0.02MPBS-吐溫緩沖液，PBS-T，pH7.4)
NaCl8.0g ；Na2HPO4 '12H2O2.93g；KH2PO4 0.2g；
KCl0.2g；NaN30.2g；蒸餾水加至1升后加Tween-200.5ml.
(3).IgG稀釋緩沖液(0.02MPBS-T，牛血清白蛋白溶液)
取0.1g牛血清白蛋白溶于用滅菌蒸餾水配制的PBS-T緩沖液100ml中即成。
(4).底物溶液(鄰苯二胺溶液)pH5.0
檸檬酸2.55g;Na2HPO4 ，12H2O9.2g加蒸餾水500ml
稱(chēng)取40mg鄰苯二胺(OPD)，溶解后過(guò)濾，加上述緩沖液至100ml，臨用前加30％H2O20.15ml即成(注意鄰苯二胺也需新鮮配制).
四.實(shí)驗步驟
1.包被抗原：取顯癥葉片和健康葉片用抗原包被緩沖液分別配制1∶10，1 ∶100，1 ∶1000樣品懸浮液，過(guò)濾或3000rpm低速離心后備用。
2.按設計(可以參考附圖設計)在酶聯(lián)板上加樣，每孔200 μl，加蓋后4℃冰箱過(guò)夜(或25℃溫箱孵育3-5小時(shí)或37℃孵育2小時(shí))。
3.用IgG稀釋緩沖液配制特異性抗體IgG稀釋液100μg/ml，10μg/ml，2 μg/ml，4℃保存備用。
4.洗滌：倒盡酶聯(lián)板上的抗原溶液,用洗滌緩沖液沖洗三次,每次3分鐘。
5.加抗體：按設計加入特異性抗體IgG,每孔150μl,25℃溫箱孵育2-5小時(shí)。
6.洗滌三次，同前。
7.用IgG稀釋緩沖液配制酶標羊抗兔IgG(工作濃度按說(shuō)明書(shū))。
8.加酶標羊抗兔IgG,每孔100μl,室溫或25℃溫箱中孵育2-5小時(shí)。
9.洗滌三次，同前。
10.底物：加底物溶液，每孔150μl，室溫20－30分鐘。
11.終止：每孔加一滴2M硫酸終止反應。
12.目測以顏色深淺記錄+++，++，+，±，-。
13.用酶聯(lián)儀(波長(cháng)492毫微米)記錄O.D值，比陰性對照讀數高二倍以上者一般判斷為陽(yáng)性。
注意：必須設置空白對照、健康對照和陽(yáng)性對照；每個(gè)樣品應2-3次重復；反應結束應立即用酶聯(lián)檢測儀讀數，否則讀數不準確。
