植物病毒血清學(xué)檢測—對流免疫電泳

    對流免疫電泳也稱(chēng)為免疫電滲電泳，抗原在堿性緩沖液(大于等電點(diǎn)pH8.2 以上)中帶負電，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)；而抗體球蛋白接近于等電點(diǎn)，借電滲液流的作用與抗原的遷移方向相反，緩慢移向陰極。故通過(guò)適當安排抗原和抗體孔的位置，在短期內(30-60分鐘)抗原和抗體可以相遇，結果在兩孔間形成沉淀線(xiàn)。

    1. 實(shí)驗材料和用具

    (1)抗血清
    (2)純化病毒或病汁液
    (3)0.05M巴比妥緩沖液,pH8.6，10％NaN3，1.5％SDS，瓊脂糖(電泳用)。

    (4)載玻片、打孔器、微量加樣器、飯盒、電泳儀和水平電泳槽、4℃冰箱。 

    2. 實(shí)驗步驟 

    (1)洗凈載玻片，泡在乙醇中，使用前取出擦干備用。
    (2)用緩沖液配制1％瓊脂糖凝膠，煮化后加入0.02％NaN3，80℃水浴中備用。

    (3)在微量離心管中將等量的1.5％SDS和提純病毒混勻，開(kāi)水浴中煮2-4分鐘備用。
    (4)用吸管吸取2ml瓊脂糖凝膠，加在載玻片上，注意保持液面水平，分布均勻，厚度為2mm，室溫下放置15分鐘，移入冰箱10分鐘使其充分凝固。
    (5)在凝膠上打孔，根據樣品數量打兩排孔，孔徑3mm，孔距3mm，排距5mm，分別標記為陽(yáng)極和陰極。
    (6)去掉孔內凝膠，抗原和待測樣品(可以作適當稀釋)包括陽(yáng)性和正常對照樣品加在陰極側一排孔中，注意不要溢出(1mm厚的凝膠加10μl)；在另一排孔中加入抗體(可用PBS稀釋)。
    (7)將玻片放入水平電泳槽，用紗布或濾紙連好電橋，抗原孔端聯(lián)負極,抗體孔端聯(lián)正極。以0.05M 巴比妥pH8.6為電泳緩沖液，電流量為4V/cm片，電泳30-60分鐘，待沉淀線(xiàn)可見(jiàn)為止。

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