植物病毒的二次提純

一. 目的

    不同濃度和穩定性的病毒可用各種方法及步驟作進(jìn)一步提純。操作過(guò)程中應注意對提純病毒的產(chǎn)量、侵染力和粒子完整性（長(cháng)條病毒）的影響。
    本實(shí)驗應用蔗糖密度梯度離心對實(shí)驗四中所得的粗提產(chǎn)品作進(jìn)一步提純，學(xué)習了解各步驟操作方法和超速離心機的使用。

二、操作步驟

  1．制備蔗糖梯度柱用BECKMAN離心機SW28型轉頭的離心管制備33ml的梯度柱。
  2．加樣2-3ml。
  3．超速離心，25,000轉，4℃2小時(shí)。
  4．取病毒帶后加入2倍容量的緩沖液稀釋。
  5．超速離心，30號轉頭，45,000轉，4℃1.5小時(shí)。保留沉淀。
  6．每管0.5—1ml緩沖液再懸浮，即為病毒提純產(chǎn)品。
  7 ．用雙光束雙波長(cháng)分光光度計分別作粗提純和精提純懸液320—220nm光譜吸收圖，比較二者的吸收峰和A260/280值的差別。

  注意：①．上樣前的粗提懸液應保證一定的濃度，才能在密度梯度離心中形成病毒帶。②．使用不同型號轉頭時(shí)加樣量不同，并應換算離心力和轉速。③．最后的超速離心沉淀應為無(wú)色半透明。

三、蔗糖梯度柱的手工制備

  根據所用的轉頭和離心管決定梯度柱的容量。
  ①．用0.01M ，pH7.0 磷酸緩沖液分別配制10 ％、20 ％、30 ％和40 ％的蔗糖液(W/W)。
  ②．以BECKMANSW28轉頭的離心管按7ml(10％)、7ml(20％)、8ml(30％)和8ml(40％) 的比例由低濃度開(kāi)始加入管中。用10ml注射器和長(cháng)針頭將蔗糖液依次注入離心管底部，最后加3ml50％(W：W)的蔗糖墊，形成由上至下，濃度由低到高的梯度柱，放置12—15小時(shí)后使用。
  操作時(shí)注意不要搖動(dòng)離心管；注入蔗糖液時(shí)動(dòng)作要慢；放置時(shí)間不可過(guò)長(cháng)或過(guò)短。

四、上樣

    不同大小的梯度管上樣量不同，SW28型轉頭的梯度離心管加樣2-3ml 。加樣時(shí)用注射器從管壁與液面成45—46o角傾斜緩緩加入，針頭高出液面2—3mm，也可用吸管或滴管加樣。

五、取樣

  1、如有可見(jiàn)帶，可用注射器和端部彎成直角的注射針頭取出。
  2 、如無(wú)可見(jiàn)帶，由液面開(kāi)始用微量取樣器順序取樣，每管1ml分別測定A260和A280值，選A260/A280 比值最接近標準者合并并作超速離心。

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