一、目的
植物病毒的提純是利用病毒粒子與寄主細胞各正常組分在理化特性上的差異，逐步將細胞成分盡可能去掉，同時(shí)保持病毒的活性。病毒提純的程序和方法有多種多樣。初步提純主要包括破碎細胞和釋放病毒、澄清提取液和濃縮病毒，得到粗提純病毒制品。
本實(shí)驗進(jìn)行TMV和PVX的初步提純，學(xué)習使用2萬(wàn)轉高速冷凍離心機。
二、TMV的提純
1.實(shí)驗材料和用具
(1)．植物材料接種TMV三周以上的普通煙(Nicotianatabacum)
(2)．緩沖液0.2M和0.01M的磷酸鈉緩沖液pH7.0
(3)．化學(xué)試劑巰基乙醇(2-ME)、正丁醇、聚乙二醇(PEG6000)、氯化鈉。
(4)．玻璃器皿量筒、燒杯、三角瓶、漏斗、滴管、吸管。
(5)．儀器變速組織搗碎機、2萬(wàn)轉高速離心機、磁力攪拌器、恒溫水浴。
2.TMV提純程序一
(1)．在組織搗碎機中勻漿系統顯癥葉片加2倍含有1％巰基乙醇的0.2M磷酸鹽緩沖
液(W/V)，3-5分鐘。
(2)．雙層尼龍紗過(guò)濾，得初提汁液。
(3)．在磁力攪拌器上邊攪拌邊加入8％正丁醇(V/V)，在葉綠素凝聚后，繼續攪拌
15分鐘。
(4)．離心，10000g4℃20分鐘，留上清液
(5)．攪拌中，依次加入4 ％的氯化鈉和4 ％聚乙二醇(W/V)，4℃下攪拌1-1.5小時(shí)
(6)．離心，10000g，4℃20分鐘，留沉淀
(7)．0.01M磷酸鹽緩沖液再懸浮沉淀(按初提純汁液2/10加緩沖液，V/V)，4℃攪拌
1小時(shí)。
(8)．離心，10000g，4℃15分鐘，留上清液
(9)．重復(5)
(10)．離心，10000g4℃20分鐘，留沉淀
(11)．0.01M磷酸鹽緩沖液再懸浮(按初提純0.5-1/10加入，V/V)
(12)．離心，10000g20分鐘，留上清液，應為乳白色病毒懸浮液，4℃保存。
3.TMV提純程序二
(1)．TMV病葉，加等量緩沖液(W/V)(0.2MPBpH7.0，4℃)
(2)．勻漿3-5分鐘，尼龍紗過(guò)濾
(3)．汁液在60℃加熱10分鐘(水浴)
(4)．5000g離心4℃5分鐘，棄沉淀
(5)．上清液依次加4 ％NaCl ，4 ％聚乙二醇(分子量6000)邊加邊攪拌，4℃下攪拌4
小時(shí)或過(guò)夜
(6)．5000g離心4℃20分鐘，棄上清液
(7)．沉淀加初汁液0.5-1/10(V/V)量的0.01MPBpH7.04℃懸浮1-3小時(shí)。
(8)．10000g離心4℃10分鐘，棄沉淀
(9)．上清液為T(mén)MV病毒初提純液
三.PVX提純
1.實(shí)驗材料和用具
(1)．植物材料接種PVX三周以上的普通煙和曼陀羅(Daturastramonium).
(2)．緩沖液0.5M磷酸鉀緩沖液+1M尿素，pH7.4
(3)．化學(xué)試劑巰基乙醇(2-ME) 、銅試劑(NaDIECA) 、氯仿(CHCL3 ) 、聚乙二醇(PEG6000)、氯化鈉、曲拉通(TritonX-100)
(4)．玻璃器皿燒杯、量筒、三角瓶、吸管、滴管
(5)．儀器同前
2.提純程序
(1) ．在組織搗碎機中勻漿系統顯癥葉片，緩沖液(1 ∶2W/V) 中加0.01M銅試劑和
0.5％巰基乙醇，勻漿3-5分鐘。
(2)．加冷卻氯仿(1 ∶1W/V)，變速研磨1分鐘。
(3)．離心，8200g，4℃15分鐘，留上層水相，得初提液。
(4)．加4 ％聚乙二醇和0.25M氯化鈉，攪拌1小時(shí)。
(5)．離心，10000g4℃30分鐘，留沉淀。
(6)．用緩沖液再懸浮沉淀，加1％TritonX-100緩沖液用量為：10ml/100ml初提液，
攪拌2小時(shí)。
(7)．離心，3000g4℃10分鐘，留上清液。
(8)．重復(4)
(9)．離心，10000g4℃30分鐘，留沉淀。
(10)．再懸浮，緩沖液用量為1ml/100ml初提液。
(11)．離心，3000g4℃10分鐘，留上清液，即為病毒懸浮液，4℃保存。
注意：(1)．如不能連續完成程序，可延長(cháng)PEG沉降或再懸浮時(shí)間；
(2)．最后再懸浮時(shí)緩沖液用量盡可能少些；
(3)．條件可能時(shí)，盡量在4℃下操作。
上一篇：植物病毒抗血清效價(jià)的測定
下一篇：植物病毒的二次提純
海博微信公眾號
海博天貓旗艦店
