大腸桿菌的常規分離鑒定方法

    在獸醫臨診或實(shí)驗中，需做分離鑒定的大腸桿菌多限于一些對畜禽有致病性的菌株，如引起初生幼畜(仔豬、犢牛、羔羊)兼或斷奶豬腹瀉的ETEC菌株、致豬水腫病和幼兔腹瀉以及雞各種大腸桿菌感染癥的病原性菌株。除對分離菌做生物化學(xué)分型鑒定和血清學(xué)分型鑒定外，還應包括對ETEC黏附素抗原和腸毒素的鑒定，對水腫病菌株的SLT-Ⅱ有條件時(shí)也可以進(jìn)行測定。至于對雞、兔和豬水腫病的菌株的菌毛鑒定且前尚處于實(shí)驗室研究階段。

    1．形態(tài)和培養特征

    致水腫病和新生仔豬腹瀉的大多數菌株可呈溶血，在麥康凱瓊脂上形成紅色菌落，伊紅美藍瓊脂上為中心暗藍黑色并有綠色金屬閃光的菌落。

    2．生化鑒定

    凡被檢菌落的細菌在三糖鐵瓊脂(TST)的反應為陽(yáng)性者，在O抗原鑒定為陽(yáng)性或與此同時(shí)進(jìn)行常規生化項目鑒定亦符合埃希菌屬的生化特性后，方可繼續作進(jìn)一步血清學(xué)定型和毒性因子測定。

已知有97％分離出的大腸桿菌產(chǎn)生葡萄糖苷酸酶，此酶能使葡萄糖苷酸-4-甲基傘形花烯(MUG)分解而生成熒光性甲基傘形花酮，可用作快速檢測。Thompson(1990)的快速法可于2Omin內完成。將應試大腸桿菌培養于哥倫比亞瓊脂基礎(Oxoid，含5％的綿羊血)，在36℃孵育18-24h。

    MUG試劑：4-甲基傘形花烯寸-D葡萄糖苷酸1OOmg，蒸餾水1OOml，三通(TritoxX-1OO)2滴，待完全溶化，用O．45tzm孑L徑濾膜行濾過(guò)滅菌，儲于無(wú)菌玻瓶?jì)�，在冰箱中可保�?/SPAN>6月。在冰箱中溶液清澄，在室溫中微濁。

    試驗：用6mmX 5Omm試管作培養。滴2-3滴(約0．5m1)MUG試劑于試管中，加熱到室溫，用一無(wú)菌接種棒刮下一部分純培養物在MUG試劑中乳化，使呈乳樣懸劑。在44．5℃水浴中孵育2Omin，此溫度可產(chǎn)生最強反應；但在22～44．5℃之間均可有滿(mǎn)意的反應。次用高強度長(cháng)波長(cháng)(366nm)紫外線(xiàn)燈在暗室內檢視，置試管于光源下15cm處，易于觀(guān)察。陽(yáng)性者發(fā)出青色熒光。

    同樣原理，葡萄糖苷酸亦可和其他各種產(chǎn)熒光性試劑結合，供檢測葡萄糖苷酶酸酶。

    3．血清型鑒定

    大腸桿菌目前有164個(gè)O抗原(O1～O171)、72個(gè)K抗原(K1～K1O3)和55個(gè)H抗原(H1～H57)，已發(fā)現的血清型至少有幾千種。因此，該菌的血清型鑒定是以O抗原、K抗原、H抗原三種抗原作為基礎的，對ETEC菌株還必須增做黏附素抗原的鑒定。鑒于ETEC和EPEC均常局限于少數O抗原群，且前者的O抗原群又與黏附素及腸毒素之間存在一定的相關(guān)性。

    因此通常對動(dòng)物ETEC和豬水腫病及禽大腸桿菌病的菌株可先確定其O抗原型，然后做完全的血清型鑒定。鑒定O抗原的抗血清必須用單因子抗()血清，以免發(fā)生交叉反應。若使用非單因子血清應以試管凝集的反應結果來(lái)判定。

    4。ETEC毒力因子的鑒定

和幼畜腹瀉有關(guān)的大腸桿菌分離物在上述生化和血清型(至少是O抗原)鑒定證實(shí)為本菌后，再鑒定其是否具有黏附素抗原和腸毒素。對腸毒素的鑒定可根據黏附素與腸毒素關(guān)系選擇適當的方法。通常，牛、羊源菌原只產(chǎn)ST，而豬源菌株多產(chǎn)LT和ST。鑒定黏附素的方法很多，一般實(shí)驗室多用玻板凝集試驗、熒光抗體技術(shù)、ELISA和MRHA及其抑制試驗等方法。鑒定腸毒素的方法常用的為兔回腸結扎試驗或仔豬小腸結扎試驗、兔皮膚藍斑試驗以及平板免疫溶血試驗等。對ST的動(dòng)物試驗只有乳鼠胃內投服試驗可用。豬水腫病菌株的SLT-Ⅱ的鑒定目前仍以Vero細胞測定法為主。

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