結核分枝桿菌分子菌種鑒定

  ①PCR菌種鑒定法。用各種分枝桿菌特異性引物對標本DNA進(jìn)行一系列PCR擴增或多重PCR擴增，根據擴增產(chǎn)物所產(chǎn)生的特異性片段進(jìn)行鑒定；或先用分枝桿菌屬特異的外部引物擴增，然后再用菌種特異的內部引物進(jìn)行巢氏擴增鑒定。該法靈敏、快速，但目前能夠鑒定的菌種尚不多，主要有MT、牛分枝桿菌、MT復合群、鳥(niǎo)分枝桿菌、副結核分枝桿菌和麻風(fēng)分枝桿菌。

    ②PCR-直接測序鑒定法。用分枝桿菌屬特異的引物對標本的16SrRNA或65ku抗原基因進(jìn)行PCR擴增，然后直接測定擴增產(chǎn)物的核苷酸序列，比較其核苷酸的差異來(lái)鑒定菌種。但該方法無(wú)法鑒別少數分枝桿菌，而且技術(shù)要求高，需昂貴的特殊儀器，而難以推廣。

    ③PCR-DNA探針鑒定法：用分枝桿菌屬特異的引物對標本中分枝桿菌16S或16S一23SrDNA進(jìn)行擴增，然后與各種分枝桿菌特異的寡核苷酸探針進(jìn)行反向斑點(diǎn)雜交或微孔板反向雜交鑒定菌種。該法較靈敏、快速，但目前只能鑒定部分菌種。

    ④PCR-限制性片段長(cháng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)鑒定法。PCR-RFLP菌種鑒定法是以分枝桿菌屬特異性引物對標本中分枝桿菌6Sku蛋白編碼基因、16S或16-23SrDNA進(jìn)行擴增，然后用不同的限制性?xún)惹忻赶�化擴增片段，通過(guò)電泳分析酶切圖譜來(lái)鑒定菌種。目前只能鑒定部分菌種，重復性還不夠理想。

    祖燕、張國龍等以DR為基礎的Spoligo typing DNA指紋方法參照“SPOLIGO TYPlNG”一書(shū)。合成43種特異的DR間隔區短核苷酸序列，并將它們依次按順序固化于Bio-dyneC膜(PallBiosupport公司)上，一般按膜大小固化數十排，以便可以同時(shí)完成多個(gè)臨床標本的Spoligotyping鑒定工作。然后用新鮮配制的16％的EDAC(Sigma公司)溶液激活固化好的生物膜，將生物膜裝置于Miniblotter MN45中待用。

    PCR擴增結核分枝桿菌基因組DNA上的重復元件DR之間的序列，引物為

    DRa：5’-GGTTTTGGGTCTGACGAC-3’

    DRb：5’-CCGAGAGGGGACGGAAAC-3’

且DRa 5’末端標記有生物素。將PCR產(chǎn)物置于固定在MiniblotterMN45中的BiodyneC膜上，增強化學(xué)發(fā)光試劑盒使之雜交、顯色，結果即為結核分枝桿菌Spoligotyping的DNA指紋圖譜。

    ⑤PCR-單鏈構象多態(tài)性分析(PCR SSCP)初步菌種鑒定法。PCR-SSCP技術(shù)是目前最廣泛應用的一種根據單鏈DNA構象差別快速、靈敏地檢測基因變異的方法。由于16SrRNA 123～275位核苷酸是分枝桿菌屬高度變異的區域，不同種分枝桿菌DNA單鏈的空間構象不同，電泳后片段的遷移率也就不同，從而呈現出不同的圖譜，最終建立了新的PCR-SSCP分枝桿菌分子菌種鑒定方法。應用該方法能夠鑒別MT復合群和NTM，NTM菌種之間的鑒別尚在研究之中。

⑥PCR-基因芯片鑒定法�；�因芯片技術(shù)是指將大量核酸分子以預先設計的方式固定在載體上，檢測帶標記的待測樣品DNA，是一種大規模分析遺傳差異的新方法。目前少數實(shí)驗室利用分枝桿菌16S rRNA或rpoB基因某些位置上的分枝桿菌屬或種特異的核苷酸變化，研究通過(guò)雜交測序鑒定分枝桿菌菌種。

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