確診布氏桿菌病的免疫學(xué)方法

1．試管凝集試驗

    采集臨床血清，預先稀釋?zhuān)�取每份預先稀釋好的4個(gè)不同稀釋度的受檢血清分別加入4個(gè)凝集試驗管內，每管o．5ml，加0．5ml 20倍稀釋的抗原于受檢血清各試管內，并振搖均勻：置3；一40℃溫箱24h，取出檢查并記錄結果。牛、馬、鹿和駱駝1：100血清稀釋度，鍺、山羊、綿羊和狗1：50血清稀釋度出現“++”以上凝集現象時(shí)，受檢血清判定為陽(yáng)性；牛、馬、鹿、駱駝1；50血清稀釋度，豬、山羊、綿羊、狗1：25血清稀釋度出現“++”以上凝集現象時(shí)．受檢血清判定為可疑反應。經(jīng)3-4周后重檢，如果仍為可疑，該牛、羊判為陽(yáng)性：豬和馬經(jīng)重檢仍保持可疑水平，而牲畜沒(méi)有臨床癥狀和大批陽(yáng)性患畜出現，該畜被判為陰性；豬血清偶有非特異性反應，須結合流行病學(xué)調查判定，必要時(shí)應配合補體結合試驗和鑒別診斷。排除耶爾森菌交叉凝集反應。

    2．補體結合試驗(CFT)

    補體結合試驗操作復雜，需有良好的實(shí)驗設施和訓練有素的人員作準確地滴定和保存試劑，盡管如此，該試驗仍在廣泛使用，而且還是公認的確診方法。指示系統是2．5％一3％的已用等體積兔抗綿羊紅細胞的血清(溶血素)致敏過(guò)的新鮮或以前保存的綿羊紅細胞懸液(SRBCs)。試驗前血清要滅活，可使用96孔U形板進(jìn)行具體操作。

    第1排一第3排每孔加25rtl稀釋的被檢滅活血清，第2排為每份血清的抗補體對照。第一排各孔不加抗原，加入CFT緩沖液(抗補體對照)。除第2排外其他各排每孔加25ul CFT緩沖液。從第3排取稀釋血清25rtl向后連續作系列倍比稀釋。

    除第1排外每孔加入25uL稀釋至工作濃度的抗原和稀釋至含所需單位的補體。

    對照孔設置  只有稀釋液，陽(yáng)性血清+補體+稀釋液，抗原+補體十稀釋液和補體十稀釋液。每一種對照總體積都設定為75uL。每一次試驗中都設有能發(fā)生最小陽(yáng)性反應的血清對照，用以檢測試驗條件的敏感性。

    微量板于37℃孵育30rain或4℃過(guò)夜，每孔加25ltl或50rtl致敏sRBC懸液，微量板于37℃再孵育30rain。

    微量板在4℃條件下1000g離心10min或4℃放置2～3h，使未溶解的紅細胞下沉，溶血程度與相當于0、25％、50％、75％和100％溶血標準進(jìn)行對比，判讀結果。第1排檢測每份血清的抗補體活性缺失情況。

    結果解釋  當滴定結果等于或大于20個(gè)國際補體結合單位(1CFUT)時(shí)結合補體呈陽(yáng)性，血清判為陽(yáng)性。在3-6月齡時(shí)曾用牛種布氏桿菌19株免疫過(guò)的母畜，如果在其18月齡或更大時(shí)進(jìn)行檢測，其血清滴定等于或大于301CFTU／m1則判定其為陽(yáng)性。

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