沙門(mén)氏菌病聚合酶鏈式反應(PCR)檢測方法

    聚合酶鏈式反應(PCR)  PCR技術(shù)因具有簡(jiǎn)便、快速、敏感性高和特異性強的優(yōu)點(diǎn)，現已廣泛應用于微生物檢測、遺傳病診斷等諸多領(lǐng)域。引物設計是利用：PCR檢測沙門(mén)菌成功與否的關(guān)鍵，用來(lái)設計PCR引物的基因主要分3類(lèi)，即屬特異性引物基因、血清群特異性引物基因與血清型特異性引物基因。屬特異性引物基因。

    ①hut基因——編碼組氨酸轉運操縱子。黃金林等根據其基因序列設計引物，建立了檢測沙門(mén)菌的PCR方法，對沙門(mén)菌A～F各群種15株沙門(mén)菌、27株沙門(mén)菌現場(chǎng)分離株和其他10株非沙門(mén)菌菌株進(jìn)行了擴增，結果沙門(mén)菌均顯示出500bp大小的特異性條帶，所有對照均不出現特異條帶，顯示了優(yōu)良的屬特異性。

    ②inv基因簇——編碼吸附和侵襲上皮細胞表面蛋白。ZnU基因簇與沙門(mén)菌對腸道上皮細胞的侵襲有關(guān)，包括invA、invB、invC、invD、invE等基因。眾多研究者均證實(shí)基于；inv基因簇設計的引物具屬特異性，可用于鑒別沙門(mén)菌。李業(yè)鵬等根據invA基因設計引物，優(yōu)化了PCR檢測條件，建立了檢測沙門(mén)菌屬的PCR檢測方法，并進(jìn)行了人工污染沙門(mén)菌的食品(生肉、雞蛋、火腿腸等)中沙門(mén)菌PCR檢測方法的應用性研究。

③hilA基因——編碼侵襲基因正調節蛋白。hilA是inv基因的正轉錄調節蛋白。

④fimA基因——編碼1型菌毛主要的亞單元。fimA基因編碼沙門(mén)菌工型菌毛主要的亞單元，介導與上皮細胞表面的特異受體相結合。H．J．Cohen等根據fimA基因設計特異引物，檢測出牛奶等食品中的沙門(mén)菌。

    ⑤hns基因——編碼與蛋白質(zhì)結合的DNA。hns基因編碼與蛋白質(zhì)結合的DNA。

    ⑥spy基因——編碼沙門(mén)菌毒性質(zhì)粒相關(guān)的毒力因子。spy基因編碼與沙門(mén)菌毒性質(zhì)粒相關(guān)的毒力因子，與沙門(mén)菌的致病性有關(guān)。J．Mahon等根據鼠傷寒沙門(mén)菌spvR基因設計引物，特異性檢測到具有該毒力相關(guān)基因的沙門(mén)菌，而不含質(zhì)粒和質(zhì)粒無(wú)該毒力相關(guān)基因的菌株則表現陰性。   

    ⑦16SrRNA基因。李君文等將常規PCR與半套式PCR相結合，以沙門(mén)菌中最保守的16SrRNA基因為模板設計了一對沙門(mén)菌屬的特異性引物，經(jīng)過(guò)優(yōu)化反應條件，敏感性提高到3CFU。血清群特異性引物基因(rfb基因)編碼沙門(mén)菌的菌體抗原(O抗原)。O抗原與沙門(mén)菌對宿主細胞的黏附、侵襲和在宿主細胞間擴散有關(guān)，是沙門(mén)菌主要的致病因子之一，刺激機體產(chǎn)生IgM抗體。目前沙門(mén)菌屬分為A～Z、051—063、065—067等46個(gè)血清群。Luk等根據rfb基因序列分別設計群特異性引物，成功用于A、B、C2、D群沙門(mén)菌的檢測。血清型特異性引物基因(沙門(mén)菌)的H抗原(鞭毛抗原)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，是沙門(mén)菌重要的毒力因子，決定其對宿主細胞表面的吸附、侵入和定居過(guò)程，刺激機體產(chǎn)生IgG抗體。沙門(mén)菌的H抗原分為H1相和H2相，根據O抗原的不同分為46個(gè)血清群，各血清群再根據H抗原各相的不同而分成不同的血清型。八匯基因——編碼H1相抗原。H1相又稱(chēng)特異相，特異性高，大多數沙門(mén)菌都具有HI相抗原，  目前型特異性引物的設計多是針對該基因。Wei等測出沙門(mén)菌幾種不同的fliC基因序列，經(jīng)序列對比分析后將沙門(mén)菌的fliC基因分為8個(gè)區，其中工區和Ⅷ區的保守性達到100％，李景鵬等利用自行設計的工區引物擴增沙門(mén)菌，證實(shí)該引物具有屬特異性。此外對PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行限制性?xún)惹忻该盖�，進(jìn)行限制性片段長(cháng)度多態(tài)性分析(RFLP)也可區分不同的血清型。

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