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摘 要： 微生物初級代謝產(chǎn)物和次級代謝產(chǎn)物的生物合成與培養基組成和培養條件密切相關(guān)，而在一個(gè)高度非線(xiàn)性、非結構化的復雜系統中要獲得最佳工藝，試驗優(yōu)化技術(shù)具有很重要的作用。綜述了單因子試驗、正交試驗、均勻設計、響應面設計、遺傳算法和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò )等優(yōu)化技術(shù)并進(jìn)行了展望。
關(guān)鍵詞： 微生物； 優(yōu)化方法； 正交試驗； 響應面設計； 均勻設計； 遺傳算法； 培養基優(yōu)化
微生物發(fā)酵是指微生物利用一些原料養分在合適的發(fā)酵條件下經(jīng)特定的代謝途徑轉變成所需產(chǎn)物的一類(lèi)復雜的生物過(guò)程，涉及到許多相互影響的因素，產(chǎn)物生物合成水平除受微生物內部代謝機理、調控機制等影響外，還有外界環(huán)境(培養基組成與配比、發(fā)酵溫度 、發(fā)酵pH、溶氧等)的影響 。因此，最大限度地合成目的產(chǎn)物并非易事，并且對于一個(gè)高度非線(xiàn)性、非結構化的復雜發(fā)酵系統而言，要建立一個(gè)準確、滿(mǎn)意的合成模型則更為困難，而試驗優(yōu)化技術(shù)的應用，特別是多元方程擬合技術(shù)(響應技術(shù))的應用可以很好地解決該問(wèn)題。傳統的優(yōu)化技術(shù)(如單因素法)雖然方法簡(jiǎn)單、易行，結果較直觀(guān)，但在考察多個(gè)因素時(shí)會(huì )浪費大量時(shí)間，且有可能導致不可靠的甚至錯誤的結論，因此，常常僅作為過(guò)程優(yōu)化的初步試驗[1]。在考察多個(gè)因素時(shí)，為了減少試驗次數，節省時(shí)間，通常采用統計優(yōu)化技術(shù)，這是因為統計優(yōu)化技術(shù)無(wú)論從試驗設計到數據分析以及模型的建立與統計學(xué)密切相關(guān)，它能夠以較少的試驗次數獲得極為豐富的統計信息。因此，被廣泛地應用于微生物發(fā)酵培養基配方的優(yōu)化中，以確定最佳發(fā)酵工藝參數，從而實(shí)現高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、低消耗等經(jīng)濟目標，本文對常用的優(yōu)化試驗方法進(jìn)行了綜述。
1 單因素試驗法
單因素試驗是在假設因素間不存在交互作用的前提下，通過(guò)一次只改變一個(gè)因素且保證其他因素維持在恒定水平的條件下，研究不同試驗水平對結果的影響，然后逐個(gè)因素進(jìn)行考察的優(yōu)化方法，是試驗研究中最常用的優(yōu)化策略之一。王曉輝等人利用單因素試驗對BS070623蛋白酶高產(chǎn)突變株進(jìn)行了發(fā)酵培養基優(yōu)化試驗，取得了良好效果。然而，對于大多數培養基而言，其組分相當復雜，僅通過(guò)單因素試驗往往無(wú)法達到預期的效果，特別是在試驗因素很多的情況下 ，需要進(jìn)行較多的試驗次數和試驗周期才能完成各因素的逐個(gè)優(yōu)化篩選，因此，單因素試驗經(jīng)常被用在正交試驗之前或與均勻設計、響應面分析等結合使用。利用單因子試驗和正交試驗相結合的方法，可用較少的試驗找出各因素之間的相互關(guān)系，從而較快地確定出培養基的最佳組合。較常見(jiàn)的是先通過(guò)單因素試驗確定最佳碳、氮源，再進(jìn)行正交試驗，或者通過(guò)單因素試驗直接確定最佳碳氮比，再進(jìn)行正交試驗。
2 正交設計試驗法
正交設計試驗法是利用一套表格，設計多因素、多指標、多因素間存在交互作用而具有隨機誤差的試驗，并利用普通的統計分析方法來(lái)分析試驗結果。正交設計試驗法對因素的個(gè)數沒(méi)有嚴格的限制，而且無(wú)論因素之間有無(wú)交互作用，均可使用。利用正交表可于多種水平組合中，挑出具有代表性的試驗點(diǎn)進(jìn)行試驗，它不僅能以全面試驗大大減少試驗次數，而且能通過(guò)試驗分析把好的試驗點(diǎn)(即使不包含在正交表中的)找出來(lái)。利用正交設計試驗得 出的結果可能與傳統的單因素試驗法的結果一致，但正交試驗設計考察因素及水平合理、分布均勻，不需進(jìn)行重復試驗，誤差便可估計出來(lái)，因而計算精度較高，特別是在試驗因素越多 、水平越多、因素之間交互作用越多時(shí)，優(yōu)勢表現越明顯，此時(shí)，使用單因素試驗法幾乎不可能實(shí)現。孟和畢力格等人利用正交試驗對傳統乳制品中產(chǎn)γ-GABA乳酸菌培養基進(jìn)行了優(yōu)化，獲得了滿(mǎn)意結果，采用優(yōu)化后的培養基于32℃發(fā)酵培養 96 h，產(chǎn)物含量高達10.78 g／L。鐘為章等人采用L16 (4)正交表對紅螺菌科光合細菌液體培養基組成進(jìn)行了優(yōu)化，利用優(yōu)化培養基在光照3000 lx、(32±2)℃條件下培養3d，細菌總數由1.63×109cfu／mL增殖至3.68x10 cfu／mL。蔡成崗等人以角蛋白酶為考察指標，采用正交試驗對枯草芽孢桿菌菌株KD—N2生產(chǎn)角蛋白酶培養基進(jìn)行了優(yōu)化研究，產(chǎn)物酶活力可達到(66.5±2.04)U／mL。在正交試驗中，如果所考察的指標涉及到模糊 因子時(shí)，不能直接使用正交設計試驗法，可以把正交試驗結果模糊化，然后用模糊數學(xué)的理論和方法處理試驗數據。陳敏等人利用模糊正交法，把試驗結果模糊化，以模糊綜合評價(jià)值為目標函數優(yōu)化了鋅酵母發(fā)酵培養基組成。模糊正交法通過(guò)把正交試驗結果模糊化，然后用模糊數學(xué)的理論和方法處理試驗數據，不僅能估計因素的主效應，還可以估計因素的最佳搭配，能在同樣試驗工作量情況下獲得更多的信息。
3 均勻設計法
均勻設計法(Uniform Design)是一種考慮試驗點(diǎn)在試驗范圍內充分均勻散布的試驗設計方法，其基本思路是盡量使試驗點(diǎn)充分均勻分散，使每個(gè)試驗點(diǎn)具有更好的代表性，但同時(shí)舍棄整齊可比的要求，以減少試驗次數，然后通過(guò)多元統計方法來(lái)彌補這一缺陷，使試驗結論同樣可靠，均勻設計一般采用二次型回歸模型：
由于每個(gè)因素每一水平只作一次試驗，因此，當試驗條件不易控制時(shí)，不宜使用均勻設計法。對波動(dòng)相對較大的微生物培養試驗 ，每一試驗組最好重復 2～3次以確定試驗條件是否易于控制，此外，適當地增加試驗次數可提高回歸方程的顯著(zhù)性。均勻設計法與正交設計試驗法相比，試驗次數大為減少，因素、水平容量較大，利于擴大考察范圍，如當因素數為5，各因素水平為3l的試驗中，如果采取正交設計來(lái)安排試驗，則至少要做312=961次試驗 ，而用均勻設計只需要做31次試驗。在試驗數相同的條件下，均勻設計法的偏差比正交設計試驗法小。在使用均勻設計法進(jìn)行條件優(yōu)化時(shí)，應注意幾個(gè)問(wèn)題：①正確使用均勻設計表，可參考方開(kāi)泰制定的常用均勻設計表，每個(gè)均勻設計表都應有一個(gè)試驗安排使用表，要注意變量、范圍和水平數的合理選擇。②不要片面追求過(guò)少的試驗次數，試驗次數最好是因素的3倍。③要重視回歸分析，為了避免回歸時(shí)片面追求回歸模型的項數、片面追求大的R2值和誤差自由度過(guò)小等問(wèn)題，可通過(guò)選擇n稍大的均勻設計表，誤差自由度≥5，回歸模型最好不大于l0，在已知實(shí)際背景時(shí)少用多項式，在采用多項式回歸時(shí)盡量考慮二次的。④善于利用統計圖表，在均勻設計中，各種統計點(diǎn)圖，如殘差圖、等高線(xiàn)圖、正態(tài)點(diǎn)圖、偏回歸圖等，對數據特性判定和建模滿(mǎn)意度的判斷非常有用。⑤均勻設計包的使用，如 DPS、SPSS、Sigmaplot、SAS等。王劍鋒[l3]等人利用均勻設計、二次多項式逐步回歸分析對煙管菌 Bjerkandera adusta WZFF．W—Y11產(chǎn)漆酶液態(tài)發(fā)酵培養基進(jìn)行優(yōu)化，在優(yōu)化條件下進(jìn)行液態(tài)培養可穩定獲得 9672U／L的漆酶活力。
4 響應面優(yōu)化設計法
響應面優(yōu)化設計法是一種尋找多因素系統中最佳條件的數學(xué)統計方法，是數學(xué)方法和統計方法結合的產(chǎn)物，它可以用來(lái)對人們受多個(gè)變量影響的響應問(wèn)題進(jìn)行數學(xué)建模與統計分析 ，并可以將該響應進(jìn)行優(yōu)化。它能擬合因素與響應間的全局函數關(guān)系，有助于快速建模 ，縮短優(yōu)化時(shí)間和提高應用可信度。一般可以通過(guò) Plackett—Burman (PB)設計法或 Central composite design (CCD)等從眾多因素中精確估計有主效應的因素，節省實(shí)驗工作量。 響應面分析法以回歸法作為函數估算的工具，將多因子試驗中因子與試驗結果的相互關(guān)系，用多項式近似，把因子與試驗結果(響應值)的關(guān)系函數化，依此可對函數的面進(jìn)行分析，研究因子與響應值之間、因子與因子之間的相互關(guān)系，并進(jìn)行優(yōu)化。周海鷗[l61等人應用 PB設計法對影響桑黃發(fā)酵的培養基組成進(jìn)行篩選，再采用 CCD設計結合響應面對影響菌絲得率的關(guān)鍵因素最佳水平進(jìn)行了深人研究，并通過(guò)二次方程回歸求解得到最優(yōu)化條件 ，此模型與預測值極為接近 ，吻合性較好。姜麗艷等人應用PB設計法對影響乳鏈菌肽液體發(fā)酵培養基組分進(jìn)行了篩選，然后采用最陡爬坡實(shí)驗逼近 3個(gè)關(guān)鍵因素的最大響應區域 ，找到了最優(yōu)化的水平，在此培養條件下進(jìn)行發(fā)酵培養，發(fā)酵液中乳鏈菌肽效價(jià)為 6033 U／mL，是優(yōu)化前的4．48倍。鐘國華¨蜘等人采用中心組分旋轉設計技術(shù)，根據菌絲干重和高效氯氰菊酯降解率，按照統計學(xué)要求檢測模型顯著(zhù)性，分析了配方組合對降解菌生長(cháng)量、高效氯氰菊酯降解率的影響和效應，采用二次多項式逐步回歸分析模型，根據響應面模型和預測回規模型方差分析對模型進(jìn)行評價(jià)，以確定最佳培養基配方。利用優(yōu)化培養基進(jìn)行培養，菌體干重為 450.30 mg／50 mL培養菌液，處理24 h對50 mg/L 高效氯氰菊酯降解率高達93.78％。
王普等人用部分因子試驗篩選了影響 Candida tropicaJis 104產(chǎn)高選擇性羰基還原酶的因素，繼而采用最陡爬坡路徑逼近最大響應區域并結合CCD和RSM 對3個(gè)顯著(zhù)性因素進(jìn)行分析，得到了優(yōu)化的培養基組成，采用該優(yōu)化培養基進(jìn)行發(fā)酵培養，供試菌株羰基還原酶活力達到 851.13 U／L，較優(yōu)化前提高了65.2％。
5 二次正交旋轉組合法前面介紹的幾種方法具有試驗設計和結果分析簡(jiǎn)單、實(shí)際應用效果好的優(yōu)點(diǎn)，在微生物培養基優(yōu)化中得到了廣泛的應用，但它們不能對各組分進(jìn)行定量分析，不能對產(chǎn)量進(jìn)行預測。所以，在正交設計試驗法的基礎上，加入組合設計和旋轉設計的思想，并與回歸分析方法有機結合，建立了二次回歸正交旋轉組合設計法(rotation regression orthogonal combination)，它是旋轉設計的一種，不僅基本保留了回歸正交設計的優(yōu)點(diǎn)，還能根據測量值直接尋求最優(yōu)區域，適用于分析參試因子的交互作用。它既能分析各因子的影響，又能建立定量的數學(xué)模型，屬更高層次的試驗設計技術(shù)�；舅悸肥抢没貧w設計安排試驗，對試驗結果用方程擬合，得到數學(xué)模型，利用計算機對模型進(jìn)行圖形模擬或數學(xué)模擬，求得模型的最優(yōu)解和相應的培養基配方，并在一定范 圍內預估 出在最佳方案時(shí)的產(chǎn)量，與響應面法有相似之處。張鐘元等人為了提高 Proteus mirabilis產(chǎn) L-肉堿脫水酶的活力，通過(guò)單因素試驗研究了碳源、氮源及誘導物等對酶生物合成的影響的基礎上，采用二次正交旋轉組合設計優(yōu)化了培養基組分配比，使L-肉堿脫水酶活力由最初的1.90 U／mL提高到了5.32 U／mL，與模型預測值較為接近，取得了預期效果。劉曉永等人為提高酵母菌中β- 葡聚糖的含量，在單因素試驗基礎上，應用二次正交旋轉組合法設計培養基成分，獲得了優(yōu)化后的培養基配方，培養基經(jīng)優(yōu)化后，酵母菌中B一葡聚糖產(chǎn)量由原來(lái)的65.80 mg／100 mL提高至108.18mg／100 mL，獲得了滿(mǎn)意的結果。
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