微生物培養基質(zhì)量控制技術(shù)和標準

摘要：微生物培養基的酸堿度、凝膠強度和選擇性等直接影響到培養基的質(zhì)量，在理化試驗方法中采用連接可滲透陶器型液體接頭的電極和平頭電極或者連接微型探頭的電極可分別測定液體和固體培養基的pH值 ，而采用 Gelometer和the LFRA Texture Analyser可測定固體培養基的凝膠強度。在微生物學(xué)方法中固體培養基采用傾注平板法、涂布法、劃線(xiàn)法(半定量法)、改良的 Miles-Misra法等測定生長(cháng)情況，液體培養基采用稀釋法測定生長(cháng)率，用目標菌和雜菌的混合菌株評價(jià)選擇性增菌培養基的選擇性，利用OD值評價(jià)液體培養基生長(cháng)率等。ICFMH (國際食品微生物學(xué)和衛生學(xué)委員會(huì )培養基工作組)、ISO、FDA以及我國衛生部等相繼制定了培養基質(zhì)量控制的標準，但目前還沒(méi)有一個(gè)系統的適合我國國情的培養基質(zhì)量控制國家標準，以致各相關(guān)單位采用的標準不一致，所以制定培養基質(zhì)量控制國家標準非常關(guān)鍵。

關(guān)鍵詞：培養基，質(zhì)量控制 ，標準

我國生產(chǎn)培養基已有相當長(cháng)的歷史，因為培養基種類(lèi)繁多，生產(chǎn)培養基的廠(chǎng)家也有很多，雖然很多相關(guān)單位都有自己的質(zhì)量控制標準，但到目前還沒(méi)有一個(gè)系統全面適合我國國情的國家標準，以致培養基的質(zhì)量參差不齊，直接影響到很多微生物學(xué)實(shí)驗結果，所以制定微生物培養基的國家標準非常關(guān)鍵。培養基質(zhì)量控制方法包括理化試驗方法和微生物學(xué)試驗方法，其中理化試驗方法包括 pH值的測定 、凝膠強度的測定等，微生物學(xué)試驗方法分固體和液體培養基的定量和半定量以及定性試驗。本文就培養基的質(zhì)量控制做一綜述，為制定培養基質(zhì)量控制國家標準提供參考。

1 培養基質(zhì)量控制方法

1.1 理化試驗方法

1.1.1 pH值測定：滅菌前后都應該測定 pH值，采用連接可滲透陶器型液體接頭的電極測定液體培養基的 pH，固體培養基可用平頭電極 (Radiometer A／S，DK-2400 Copenhagen NV，Denmark)或者連接微型探頭的電極(Microelectrodes Inc．，NH03053，U.S.A)測定pH。pH值在滅菌前后均需測定，測量時(shí)盡量使培養基溫度降到20℃～25℃，校正通常用接近40g／L的NaOH或者接近36.5g／L(約1mol／L)HC1。

1.1.2 凝膠強度測定：凝膠強度也是一個(gè)重要指標，滅菌條件特別是pH會(huì )影響凝膠強度。Gelometer(Marine Colloids Inc．，2，Edison Place，Springfield，NJ 0708 1，U．S．A．)和the LFRA Texture Analyser(C．S．Stevens&Son Ltd．Dolphin Yard，Holywell Hill，St．Albans，Herts，U．K．)均能提供良好的測量性能。這種儀器利用直徑為10mm～25mm的圓柱形金屬探頭測量壓破瓊脂表面時(shí)所需的壓力。

一般理化試驗可迅速測出配方中存在的錯誤，而不需等待微生物培養試驗，因此理化試驗是培養基質(zhì)控的有效手段。

1.2 微生物學(xué)試驗方法

1.2.1 質(zhì)控菌株的保存：一般細菌保存菌種的制備可從質(zhì)控菌株接種于含5％羊血的胰蛋白胨大豆瓊脂培養基 (TSA)上，在合適的環(huán)境和溫度下孵育18—24h，接種以后，通過(guò)菌落形態(tài)檢查純度和驗證一致性。必要時(shí)實(shí)施生化試驗。然后制成凍干菌種，或制成含有10％到15％甘油的防冷凍培養物置于-50％或更低的溫度保存備用。在低于-70％的溫度下菌株可以無(wú)限期保存，在-50℃～-70℃僅能保存1年，通常不應在-50℃以上的溫度保存。真菌可用特別制備的馬鈴薯冷凍瓊脂制成斜面，培養后至-20℃能保存1年。

1.2.2  固體培養基的試驗方法：(1)改良的Miles-Misra法 ：將新鮮菌種用蛋白胨水稀釋?zhuān)粚⒃囼灪蛯φ张囵B基做成4mm厚的平板并使平板表面干燥；對試驗和對照培養基進(jìn)行系列稀釋度接種，每稀釋度各取4滴分別加入4個(gè)試驗和對照培養基；每l滴的涂布超過(guò)1／4平板，并用涂布器從高稀釋度開(kāi)始涂布；培養平板并對數量和菌落形態(tài)進(jìn)行評價(jià)。

評價(jià)方法：生長(cháng)率 (productivity ratios，P_R) =N₈／N₀，N₀=對照培養基的菌落數，N₈=試驗培養基的菌落數；m和 M：m表示 80％的菌株需要符合的生長(cháng)率，M表示100％的菌株需要符合的生長(cháng)率，滿(mǎn)意的生長(cháng)率見(jiàn)表1。

表1 滿(mǎn)意的生長(cháng)率

(2)劃線(xiàn)法 (半定量)  ：平板如圖 l所示，A、B、C區中4條平行線(xiàn)大概相隔

0.5cm，正常情況下，一環(huán)從 A區劃到D區。

評價(jià)方法：接種以后，評定菌落形態(tài)、菌落大小、生長(cháng)強度和計算生長(cháng)指數G。每條線(xiàn)都表示1個(gè)分數。最大分數是 16。如果只生長(cháng)到線(xiàn)的一半就認為數值是0.5。沒(méi)有生長(cháng)或者只有很少量 (少于一半)的生長(cháng)，分數0。分數加起來(lái)得到G。例如，如果生長(cháng)到 A區，B區，C區的一半，那么生長(cháng)分數G就是10。目標菌株的生長(cháng)指數應該至少是6。如果是非選擇培養基G。就應該是更高。另外，目標菌株的生長(cháng)應該是典型的，非目標菌株應該部分或全部被抑制。

(3)定性質(zhì)控方法：用1ul的接種環(huán)在試驗培養基表面上劃平行線(xiàn)，接種試驗微生物�？梢栽谕�一個(gè)培養基上不交叉地接種幾種不同的試驗微生物。

評價(jià)方法：接種以后的生長(cháng)情況：0相當于不生長(cháng)；1相當于弱生長(cháng)；2相當于強生長(cháng)。目標微生物的分數應該是 2并且要有典型的特征，大小和菌落形態(tài)。非目標微生物的生長(cháng)應該被部分或全部抑制(0或1)。

1.2.3 液體培養基的試驗方法：(1)目標和非目標微生物的定量稀釋方法：選擇液體培養基 10mL／管待檢；目標微生物的接種：將少量的 (如 10～100cfu／管)試驗菌株接種到試驗和對照肉湯，并混勻；非目標微生物的接種：將大量的 (>l000 cfu／管)試驗菌株接種到試驗和對照肉湯，并混勻；接種目標和非目標微生物作為混合菌種：為了得到混合菌種在選擇培養基上的生長(cháng)情況，接種少量的 目標微生物 (如 l0～100cfu／管)到試驗肉湯和對照肉湯，并且接種更大量 (>1000cfu／管)的非目標微生物到相同的管中，并混勻；每種肉湯接種培養后涂布到非抑制性培養基平板上。

評價(jià)方法：計算目標和非目標微生物的菌落數，用 Pr 和Sf 進(jìn)行結果的解釋。

Pr (同前所述)：目標微生物的P 應該不小于0.1。

Sf (選擇性因子)的計算如下 ：Sf=Do-Ds.

這里Do是對照培養基上至少10個(gè)菌落的最高稀釋度，Ds是試驗培養基上至少 l0個(gè)菌落的最高稀釋度。Sf, Do和Do采用 log10 。為單位來(lái)表示。例如：如果 Do 10 =log 4 =4，而 Ds 10-3=log103.0=3，那么選擇性因子就是 Sf =1.0。非目標微生物的Sf至少應該是2。

在混合菌種中目標微生物不應被非目標微生物抑制，也就是說(shuō)目標微生物應該是占多數。

(2)利用OD值評價(jià)液體培養基生長(cháng)率：一種自動(dòng)微生物生長(cháng)分析儀 Bioscreen microbialogical growth analyzer(Labsystems Oy，Helsinki，Finland)用于比較試驗液體培養基和對照液體培養基培養后微生物的數量，動(dòng)態(tài)測量 OD值，并將數據轉換成生長(cháng)曲線(xiàn)，該OD值與微生物數量有極好的相關(guān)性。這種方法不需作系列稀釋?zhuān)�并且減少試驗材料的需要，是一種便宜、快速和可靠的方法。

2 培養基質(zhì)量控制標準

2.1 國外培養基質(zhì)量控制標準  1984年，國際食品微生物學(xué)和衛生學(xué)委員會(huì )培養基工作組 (The International Committee for Food Microbiology and Hygiene，Working Party for Culture Media)(ICFMH，WPCM)提出生物培養基質(zhì)量控制的標準方案，制定了檢驗培養基質(zhì)量的導則和標準，其后又補充了工作組發(fā)表過(guò)的一些專(zhuān)題論文和試驗方法。

美國食品與藥品管理局 (FDA)早在80年代就對培養基制造商建立了生產(chǎn)條例。美國國家臨床實(shí)驗室標準委員會(huì )培養基質(zhì)量控制委員會(huì ) (The National Committee for Clinical Laboratory Standards，Subcommittee on Media Quality Contro1) (NCCLS)在 1985 年提出并在 1990年通過(guò)了導則“M22-A商品微生物培養基質(zhì)量控制”的標準，1996年修改第二版，2001年修改第三版。

ISO在2000年制定了一份技術(shù)規格標準：“ISO／TS 11133-1食品和動(dòng)物飼料微生物學(xué)——制備和生產(chǎn)培養基的導則  第一部分：實(shí)驗室制備培養基質(zhì)量控制的一般導則”。2003年又制定了 “ISO／TS11133-2食品和動(dòng)物飼料微生物學(xué)——制備和生產(chǎn)培養基的導則——第二部分：培養基檢驗規程的應用導則”。

美國藥典和歐洲藥典均對液體硫乙醇酸鹽和胰蛋白胨大豆肉湯兩種無(wú)菌檢查培養基進(jìn)行促菌生長(cháng)試驗，規定兩種培養基在質(zhì)控菌少量接種 (10—100cfu)的情況下須生長(cháng)良好。但沒(méi)有對其它培養基進(jìn)行質(zhì)控要求，而且質(zhì)控要求也不夠系統。

2.2 我國培養基質(zhì)量控制標準  中國微生物學(xué)會(huì )培養基學(xué)組 1990年以來(lái)對培養基的原材料和部分商品培養基相繼提出了質(zhì)控標準。我國衛生部 1993年制定了 “食品衛生微生物檢驗用于燥培養基生產(chǎn)質(zhì)控和質(zhì)量標準”；2002年衛生部醫政 司參考 NCCLS標準制定了衛生行業(yè)標準：“WS／T232-2002商業(yè)性微生物培養基質(zhì)量檢驗規程”，緊接著(zhù)2005年中華人民共和國藥典規定了對需氣菌、厭氣菌培養基和真菌培養基3種無(wú)菌檢查培養基進(jìn)行促菌生長(cháng)試驗。

3 討論

我國衛生行業(yè)標準 “WS／T232-2002商業(yè)性微生物培養基質(zhì)量檢驗規程”微生物生長(cháng)試驗為定性結果，結果的判斷可操作性需進(jìn)一步提高。美國國家臨床實(shí)驗室標準委員會(huì )制定的 “M22-A商品微生物培養基質(zhì)量控制”的標準也有類(lèi)似情況。而 WPCM將培養基的質(zhì)控結果定量并分為 5個(gè)級別，使結果易于判斷，因此建立的質(zhì)控標準應該盡可能定量。2001年加拿大對 Ontario的124個(gè)實(shí)驗室進(jìn)行考查，得出的結果是大多數實(shí)驗室不能完全達到 NCCLS標準的要求，表現為一些培養基根本沒(méi)有進(jìn)行質(zhì)控，另外一些問(wèn)題是：沒(méi)有采用要求指定的ATCC菌株、培養的溫度和時(shí)間不適宜、成品培養基沒(méi)有物理特性的檢查記錄、大多數實(shí)驗室沒(méi)有供應商的控制報告等。因此制定的試驗方法在可得出可靠結果的同時(shí)，應考慮我國國情，盡量簡(jiǎn)單易行，如果要求較高的操作技術(shù)水平或昂貴的設備儀器，則標準難以普及執行。此外，質(zhì)控菌株的選用還應側重考慮我國食品衛生細菌污染的實(shí)際狀況。質(zhì)控標準的試驗方法均需要對照培養基進(jìn)行評價(jià)，在我國衛生部 1993年制定了 “食品衛生微生物檢驗用干燥培養基生產(chǎn)質(zhì)控和質(zhì)量標準”中采取 自配的新鮮培養基為對照培養基尚需進(jìn)一步斟酌，因自配培養基本身不定因素很多，而選用合適的培養基作對照相當關(guān)鍵。

由于食品微生物培養基品種較多，而國內可參考的資料不多，國外的一些標準起點(diǎn)可能較高，不一定完全適合我國情況，因此標準和試驗方法的制定工作量較大，可以參考 ISO標準，將制定標準分為兩步，首先制定一般導則，再制定標準和試驗方法。ISO標準的一般導則較為系統，從生產(chǎn)商的產(chǎn)品供應到實(shí)驗室制備、產(chǎn)品使用、產(chǎn)品銷(xiāo)毀和最終產(chǎn)品的質(zhì)量控制等各方面和各環(huán)節均作出了詳細規定，可作為我國制定微生物培養基質(zhì)控標準的重要參考。

作者：吳清平  孟凡亞  蔡芷荷  劉秀梅  楊 寧

參 考 文 獻

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