枯草芽孢桿菌原生質(zhì)體的制備

枯草芽孢桿菌原生質(zhì)體的制備 

    1. 培養枯草芽孢桿菌 
取親本菌株T4412、TT2 新鮮斜面分別接一環(huán)到裝有液體完全培養基(CM)的試管中，36℃振蕩培養14 h，各取1 mL 菌液轉接入裝有20 mL 液體完全培養基的250 mL 錐形瓶中，36℃振蕩培養 3 h，使細胞生長(cháng)進(jìn)入對數前期，各加入25 u/mL 青霉素，使其終濃度為0.3 u/mL，繼續振蕩培養2 h。 

    2. 收集細胞 
各取菌液10 mL，4000 r/min 離心10 min，棄上清液，將菌體懸浮于磷酸緩沖液中，離心。如此洗滌兩次，將菌體懸浮10 mL SMM 中，每mL 約含108～109 活菌為宜。 

    3. 總菌數測定 
各取菌液0.5 mL，用生理鹽水稀釋?zhuān)��?0-5、10-6、10-7 各1mL(每稀釋度作兩個(gè)平板)、傾注完全培養基，36℃培養24 h 后計數。此為未經(jīng)酶處理的總菌數。 

    4. 脫壁 
    二株親本菌株各取5 mL 菌懸液，加入5 mL 溶菌酶溶液，溶菌酶濃度為100 ug/mL，混勻后于36℃水浴保溫處理30 min，定時(shí)取樣，鏡檢觀(guān)察原生質(zhì)體形成情況，當95%以上細胞變成球狀原生質(zhì)體時(shí)，用4000 r/min 離心10 min，棄上清液，用高滲緩沖液洗滌除酶，然后將原生質(zhì)體懸浮于5 mL 高滲緩沖液中。立即進(jìn)行剩余菌數的測定。 

    5. 剩余菌數測定 
    取0.5 mL 上述原生質(zhì)體懸液，用無(wú)菌水稀釋?zhuān)�使原生質(zhì)體裂解死亡，取10-2、10-3、10-4 稀釋液各0.1 mL，涂布于完全培養基平板上，36℃培養24～48 h，生長(cháng)出的菌落應是未被酶裂解的剩余細胞。 
    計算酶處理后剩余細胞數，并分別計算二親株的原生質(zhì)體形成率。原生質(zhì)體形成率＝未經(jīng)酶處理的總菌數一酶處理后剩余細胞數。

枯草芽孢桿菌常用培養基的配制方法;

1L蒸餾水+20g葡萄糖+15g蛋白胨+5g氯化鈉+0.5g牛肉膏+20g瓊脂

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