五種培養基分離E1-Tor霍亂弧菌比較

4號 、慶大 、亞膽 、亞洗、雙洗都是分離 El—Tor霍亂弧菌的常用培養基。我們利用浙江省衛生防疫站制備的上述幾種培養基成品，對污染不同量 El—Tor霍亂弧菌的大便標本進(jìn)行了分離培養，現將實(shí)驗方法和結果報告如下：

1 材料與方法

1.1 抑制劑

1.1.1  1％ 亞碲 酸鉀 ；

1.1.2  250μ/ml慶大霉素(蕪湖制藥廠(chǎng))；

1.1.3  10％膽汁酸鹽；

1.1.4  1500μ／ml多粘菌素 B(英國進(jìn)口)；

1.1.5  0.1％硫酸雙氫鏈霉素(上海第十制藥廠(chǎng))；

1.2 培 養基

1.2.1  堿性胨水   取堿性胨水粉末 26g，加 l000ml蒸餾水，加熱溶解，分裝試管，15磅 15min高壓滅菌。

1.2.2  堿性瓊脂   取堿性胨水粉末26g，牛肉膏3-5只，加1000ml蒸餾水，加熱溶解，校正 pH8.4，分裝，加 1.2％瓊脂粉，15磅高壓滅菌，待冷至 5O℃左右，傾注滅菌平皿。

1.2.3  4號瓊脂   取4號瓊脂粉44g，加1000ml蒸餾水，加熱溶解，煮沸二次，待冷至50℃左右，加 1％亞碲酸鉀 lml，500μ／ml慶大霉素 lml，充分混勻 ，傾注滅菌平皿。

1.2.4  亞膽瓊脂  取亞膽瓊脂粉42g，加 1000ml蒸餾水，加熱溶解，15磅高壓滅菌，待冷至50℃左右，加10％膽汁酸鹽 15ml，1％亞碲酸鉀 lml，充分混勻，傾注滅菌平皿。

1.2.5 慶大霉素瓊脂  取慶大霉素瓊脂粉53g，加1000ml蒸餾水，加熱溶解，15磅高壓滅菌，待冷至 50℃左右，加250μ／ml慶大霉素2ml，1500μ／ml多粘菌素 B 2ml，充分混勻，傾注滅菌平皿。

1.2.6 亞洗瓊脂 取蛋白胨20g，氯化鈉5g，洗衣粉(上海 )2.5g，牛肉膏 3—4g，先加少量蒸餾水溶解，再加蒸餾水至 l000ml， 校正pH8.4，加1.2％瓊脂粉，15磅高壓滅菌，待冷至50℃左右，加1％亞碲酸鉀1ml，充分混勻，傾注滅菌平皿。

1.2.7 堿性瓊脂斜面   高壓滅菌。

1.2.8  0.85％生理鹽水  高壓滅菌。

1.2.9  El—Tor霍亂弧菌(系1980—1981年各縣分離上送菌株)；

80—953號：稻葉非溶復株(黃巖)；80—409號：稻葉復愈株(臨海)；80—1124號：稻葉復愈株(三門(mén))；81—1號：小川溶源株(溫嶺)；81—166號：小川復愈株(黃巖)；81—118號：小川 復愈株(黃巖)。

1.2.10 大便標本   采自臺州醫院腸道門(mén)診化驗大便，共30 份，其中：粘液便8份、稀便4份、水樣便1份、膿血便1份、黃軟便16份。

1.2.11  霍亂弧菌“O”多價(jià)診斷血清  系上海生物制品研究所提供，效價(jià)1：1280／+，經(jīng) 1：20稀釋使用。

1.3 方法

1.3.1 用細竹簽挑取2g左右大便，接種于堿性胨水管內，置37℃增菌6h。

1.3.2 將37℃12h斜面瓊脂培養后的El—Tor霍亂弧菌，用滅菌生理鹽水洗下，用比濁法測定弧菌量，并稀釋成 64萬(wàn)個(gè)／ml、32萬(wàn)個(gè)／ml、16萬(wàn)個(gè)／ml、8萬(wàn)個(gè)／ml、4萬(wàn)個(gè)／ml弧菌懸液，然后，吸取 1ml加入增菌后的胨水管內，充分混勻，置室溫30min。

1.3.3 用同一接種環(huán)挑取上述含有不同菌量El—Tor霍亂弧菌的大便增菌液，分別以一滿(mǎn)環(huán)劃種于已烘干表面水份的亞洗、慶大、雙洗、亞膽，4號各一只培養基上，經(jīng)37℃12h及24h 培養后，分別觀(guān)察結果。

1.3.4 挑取 El-Tor霍亂弧菌可疑菌落，用1：20稀釋的霍亂弧菌“O”多價(jià)血清做玻片凝集；陰性者，再挑選5-10只菌落凝集。

2 結果

2.1 五種培養基分離人工污染 El—Tor霍亂弧菌，結果見(jiàn)表 1。

表 1 五種培養基分離人工污染 El—Tor霍亂弧菌結果

注 ：表內 “+”表示 陽(yáng)性 ，“-”表 示陰性

從表 l可知，五種培養基同時(shí)分離30份人工污染 El—Tor 霍亂弧菌，經(jīng)37℃12h培養，4號、慶大、亞膽、雙洗、亞洗平板檢出率分別為 90.0％、33.3％ 、6.7％ 、20.0％、0％；經(jīng) 37℃24h培養，其檢出率分別為 90.0％ 、40.0％ 、23.3％、20.0％、6.7％。 經(jīng)χ²檢驗五種培養基檢出率有非常顯著(zhù)差異(P<0.01)4號培養基檢出率顯著(zhù)高于其它四種培養基。

2.2 不同血清型 El—Tor霍亂弧菌在4號培養基上檢出率比較見(jiàn)表 2。

表 2 不同血清型 El—Tor霍亂弧菌

在 4號培養基上的檢出率比較

P<0.11差異無(wú)顯著(zhù)性(直接計算法)

3 討論

3.1 人工污染不同菌量El—Tor霍亂弧菌(6株)的30份大便標本，在4號、慶大、亞膽、雙洗、亞洗培養基上的陽(yáng)性檢出率，分別為90.0％、40.0％、23.3％、20.0％、6.7％。實(shí)驗表明：用4號平板分離El—Tor霍亂弧菌陽(yáng)性檢出率顯著(zhù)高于其它四種培養基。而慶大、亞膽、雙洗、亞洗之間的檢出率除慶大與亞膽外，其余均無(wú)顯著(zhù)差異。

3.2 4號培養基能提高陽(yáng)性檢出率的主要原因是培養基中亞硫酸鈉及檸檬酸鈉能促進(jìn)E1一Tor霍亂弧菌的生長(cháng)。使菌落大而典型；豬膽法(或膽法酸鹽)也能促進(jìn) El—Tor霍亂弧菌的生長(cháng)，并有一定的穩定保護作用，減少抑制劑對弧菌的影響；十二烷基硫酸鈉作為表面活性 劑能減少培養基的表面張力，使部分雜菌崩解，同時(shí)也有利于El—Tor霍亂弧菌的生長(cháng)：采用亞碲酸鉀、慶大霉素及雷佛奴爾作為抑制劑，能抑制在部分的革蘭陽(yáng)性菌及部分腸道革蘭陰性菌，相互之間又有協(xié)同作用，增加了抑菌譜；因此，在平板中雜菌幾乎全部被抑制，E1- Tor霍亂弧菌呈純培養，致使早期就能在原始劃線(xiàn)區檢到少數El—Tor霍亂弧菌菌落，從而提高了陽(yáng)性檢出率。

3.3  4號平板分離El-Tot霍亂弧菌有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：

3.3.1 菌落典型。即菌落較大，中心黑色，扁平、光滑周?chē)�、整齊并且比較透明。容易和其它雜菌鑒別。

3.3.2 抗原性強。El-Tor霍亂弧菌菌落很易挑起乳化，能和霍亂“O”多價(jià)血清迅速凝集。

3.3.3 EI-Tor霍亂弧菌不同血清型間的檢出率沒(méi)有顯著(zhù)差異。

3.3.4 檢出率高，檢出時(shí)間短。

實(shí)驗表明：4號培養基干粉具有配制簡(jiǎn)便，不需高壓，檢出快速，陽(yáng)性率高，抑制雜菌效果好，觀(guān)察結果方便等優(yōu)點(diǎn)，實(shí)為我們實(shí)驗室分離El—Tor霍亂弧菌理想的一種培養基。

作者：鄭官增

作者單位：臺州市疾病預防控制 中心，浙江 318000

參 考 文 獻

[1]李影林 主編 ．臨 床微生物學(xué) 及檢驗 [M]．吉林 科學(xué)技術(shù) 出版社， 1991；9：245—253．  ’

[2]衛生部疾病控制司編 ．(第 5版)．霍亂防治手冊。1999：48—111．

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