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2培養基
改良馬丁瓊脂培養基:用于黑曲霉復蘇、復壯.
液體硫乙醇酸鹽培養基:用于生孢梭菌復蘇、復壯.
營(yíng)養肉湯培養基:用于金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門(mén)菌、短小芽孢桿菌、銅綠假單胞菌復蘇、復壯。
改良馬丁培養基:用于白色念珠菌復蘇、復壯.
3操作步驟：
a.打開(kāi)潔凈工作臺。
b.在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并讓其自然風(fēng)干。
c.用一小砂輪在安瓿的上部劃一條線(xiàn)，用手輕輕將安瓿掰開(kāi)（開(kāi)啟安瓿時(shí)必須小心，因為安瓿遇熱時(shí)可能會(huì )破裂）。
d.以無(wú)菌方法用一無(wú)菌吸管從已準備好的上述液體培養基中移取0.5～0.8 ml到安瓿中。
e.輕輕地旋轉安瓿以使凍干菌種和液體培養基充分混合并完全溶解。
f.用無(wú)菌吸管將安瓿內菌液全部轉接到相應的液體培養基。
g.根據安瓿上所標明的不同菌種類(lèi)型而將其培養于相應的溫度（細菌培養溫度30～35℃，培養18～24小時(shí)；真菌培養溫度23～28℃，培養3～5天。觀(guān)察是否渾濁，渾濁說(shuō)明菌種復蘇生長(cháng)；若不渾濁，細菌應延長(cháng)培養時(shí)間至7天，真菌應延長(cháng)培養時(shí)間至14天，若仍未渾濁，滅菌處理。
h.黑曲霉的菌懸液先室溫待菌懸液融化后用無(wú)菌吸管吸取管內液體1～2滴滴在改良馬丁瓊脂斜面上，用吸管涂布均勻，置23～28℃培養5～7天，斜面正面為黑褐色厚絨狀，色澤均一，不應有雜色，斜面側面無(wú)色，接近菌層培養基略帶黃色。確認后用含有0.05%（ml/ml）的吐溫-80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液洗脫到無(wú)菌試管中。
i.取經(jīng)復蘇后的上述細菌菌液8-10ml至液體培養基中按g項操作對菌種進(jìn)行復壯。以無(wú)菌技術(shù)向復壯后的菌種中加入100ml20%的無(wú)菌甘油混勻，1-2ml/管分裝于凍存管。每個(gè)菌種制備10支，按順序進(jìn)行編號，最后一支做為質(zhì)控管進(jìn)行質(zhì)量控制，即進(jìn)行相應的確認。其余作為儲備管。黑曲霉的h項下洗脫液按h項下方法進(jìn)行復壯，制成復壯后的孢子懸液20ml。以無(wú)菌技術(shù)向復壯后的菌種中加入20ml 、30%的無(wú)菌甘油混勻，1-2ml/管封存于凍存管。制備10支，按順序進(jìn)行編號，最后一支做為質(zhì)控管進(jìn)行質(zhì)量控制，即進(jìn)行相應的確認。其余作為儲備管。將上述制備好的凍存管逐支粘貼標簽。內容包括：菌種名稱(chēng)、菌種代號、編號、代次、制備日期、制備人、貯存條件、有效期至等。
j．儲備菌種管制備成功，儲存于－20℃，有效期為三年。
4菌種確認
用無(wú)菌接種環(huán)從質(zhì)控管中取細菌培養物接種到營(yíng)養瓊脂培養基平板上，或相應的宜于該細菌生長(cháng)的鑒別平板上，劃線(xiàn)分離出單個(gè)菌落。然后在30～35℃下培養2～3天；同樣的方法取真菌到玫瑰紅鈉瓊脂培養基平板，并在23～28℃下培養7天；培養后，觀(guān)察其菌落形態(tài)，應符合該菌種形態(tài)特征。
5污染處理
假如在該平板上發(fā)現有其他菌落生長(cháng)，則說(shuō)明或操作有污染或菌種不純。將此被污染了的培養物滅菌處理�？蓪ふ以蛑匦路蛛x挑選純菌落轉接斜面菌種作為第四代。并重新制備儲備菌種管
6菌種的傳代與保藏
將菌種接種至一新鮮培養基上，每萌發(fā)一次即稱(chēng)為一代，因此，當原始菌種復溶并轉至新培養基內生長(cháng)，即認為已傳代一次，從菌種保藏中心獲得的冷凍干燥的菌種為第0代，冷凍干燥的原始菌種開(kāi)啟后轉種后為第1代，直到第3代為工作菌種。菌種的傳代次數（自原始菌種凍干粉起）不得超過(guò)5代。
菌種的傳代保藏過(guò)程
3項下標準菌的復蘇為傳第一代，復壯為第二代。 傳第三代時(shí)取1支凍存管自然解凍，將其轉接斜面菌種作為工作用菌種。此時(shí)，工作用菌種為第3代。工作用菌種，分為兩類(lèi)：一類(lèi)用于定期傳代(W3)，一類(lèi)用于實(shí)驗用（S3）。
定期傳代用菌的傳代其操作步驟如下（斜面接種法）：
（1）從冰箱冷藏室中取出菌種斜面后，應在室溫放置約30分鐘。
（2）將裝有新鮮配制的培養基菌種保藏管管壁上注明菌名及接種日期，和傳代菌種一并移入潔凈工作臺，打開(kāi)紫外燈照射一小時(shí)。
（3）關(guān)閉紫外燈。點(diǎn)燃酒精燈，左手握住菌種斜面，將管口靠近火焰上方，右手拿接種棒后端，將接種環(huán)燒紅約30秒，隨后將接種棒金屬部分在火焰上燒灼，往返通過(guò)三次。
（4）右手用無(wú)名指、小指及掌部夾住管塞，左手將管口在火焰上旋轉燒灼，右手再輕輕拔開(kāi)管塞，將接種環(huán)伸入管內先在近壁的瓊脂斜面上靠一下，稍冷后再至菌苔上，刮取少量菌苔，隨即取出接種棒并將菌種管口移至火焰上方�！�
（5）塞上管塞，左手將菌種管放下，取營(yíng)養瓊脂斜面（或改良馬丁瓊脂斜面）一支，照上述操作打開(kāi)管塞，將接種環(huán)伸入管內至瓊脂斜面的底部向上劃一條直線(xiàn)，然后從底部向上作連續曲線(xiàn)劃線(xiàn)，一直劃到斜面頂端，使細菌接種在斜面的表面上。
（6）取出接種環(huán)，在火焰上方將培養基管蓋上塞子，然后將接種過(guò)細菌的接種環(huán)在火焰上燒灼滅菌。
（7）將已接種好的細菌管置30～35℃細菌培養箱培養22 ～24h，真菌管置23～28℃真菌培養箱最多培養7天。
當工作用菌種傳代代數小于5時(shí)，可直接用上一代工作用菌種轉接下一代工作用菌種，如：（W3）可直接轉接為（W4）。按上述程序操作，直至（W4）轉為（W5）為止，需重新接種，舊的工作菌種進(jìn)行銷(xiāo)毀。
上一篇：標準菌株的來(lái)源與驗收
