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實(shí)驗室診斷主要包括以檢測致病菌及其抗原、產(chǎn)物或核酸為目的的細菌學(xué)診斷，以及檢測患者血清中特異性抗體為目的的血清學(xué)診斷。
一、細菌學(xué)診斷
（一）標本采集
細菌感染性疾病的實(shí)驗室檢查結果主要取決于臨床標本的質(zhì)量、采集時(shí)間及方法、實(shí)驗人員的技術(shù)熟練程度及經(jīng)驗。臨床醫生應該知道何時(shí)和怎樣采取標本，需作哪些實(shí)驗室檢查，以及如何解釋結果。為提高致病菌檢出率，避免診斷錯誤或漏檢，標本采集與送檢過(guò)程應遵循下列原則：
1．嚴格執行無(wú)菌操作，盡量避免患者正常菌群或外界環(huán)境中雜菌污染標本。采取局部病變標本處，不可用消毒劑，必要時(shí)宜以無(wú)菌生理鹽水沖洗，拭干后再取材。從呼吸道、消化道、泌尿生殖道、傷口或體表分離可疑致病菌時(shí)，應與其特定部位的正常菌群及臨床表現一并加以考慮，因為目前內源性感染呈不斷上升趨勢。
2．根據致病菌在患者不同病期的體內分布和排出部位，采集不同的標本（表7-1）。例如流行性腦膜炎患者取腦脊液、血液或出血瘀斑；傷寒患者在病程第1～2周內取血液，第2～3周時(shí)可取糞便。盡可能采集病變明顯部位的材料。
3．應在疾病早期和使用抗菌藥物之前采集標本，否則可能需停藥數天后采集，或者在分離培養時(shí)加入藥物拮抗劑。
4．標本必須新鮮，采集后盡快送檢，尤其是檢測抵抗力弱的細菌。若不能立即送檢，應將標本置于特殊的轉運培養基中，低溫保存，以減緩致病菌的死亡，阻止雜菌的過(guò)度生長(cháng)。送檢過(guò)程中，除不耐寒冷的腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌等要保溫外，多數菌可冷藏送運。
（二）致病菌的檢驗程序
主要有直接涂片染色鏡檢、分離培養、生化試驗、血清學(xué)試驗等，有的尚需作動(dòng)物試驗等。細菌學(xué)快速診斷新技術(shù)主要有核酸雜交（nucleic acid hybridization）和聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction, PCR）等。敏感性、特異性和檢測效率是影響臨床診斷程序選擇的重要因素。
1．直接涂片染色鏡檢 直接涂片染色鏡檢法可在顯微鏡下直接觀(guān)察致病菌的形態(tài)、大小、排列方式和染色特點(diǎn)。凡在形態(tài)和染色性上具有特征的致病菌，直接涂片染色后鏡檢有助于初步診斷。例如痰中查見(jiàn)抗酸性細長(cháng)桿菌，腦脊液或淤血點(diǎn)中查到腎形成雙排列的革蘭陰性球菌，膿液中發(fā)現革蘭陽(yáng)性葡萄串狀球菌，或咽喉假膜中有異染顆粒的棒狀桿菌時(shí)，可分別初步診斷為結核分枝桿菌、腦膜炎奈瑟菌、葡萄球菌或白喉棒狀桿菌。此外，尿沉渣中發(fā)現優(yōu)勢菌類(lèi)，或長(cháng)期腹瀉患者糞便中發(fā)現革蘭陽(yáng)性球菌和真菌等優(yōu)勢菌，均有重要的診斷價(jià)值。在某些情況下，也可在直接涂片后，以特異性熒光抗體染色，在熒光顯微鏡下觀(guān)察，若出現有發(fā)熒光的菌體就是欲檢驗的細菌。例如糞便中的志賀菌、霍亂弧菌，以及呼吸道標本中的嗜肺軍團菌和百日咳鮑特菌等可用此技術(shù)快速檢出。
染色或不染色標本的形態(tài)學(xué)檢查法較為簡(jiǎn)便、快速、價(jià)廉，為臨床檢驗所常用，特別是有的細菌尚不易進(jìn)行人工培養，或培養時(shí)周期較長(cháng)，只能通過(guò)直接涂片染色并結合臨床確診。但是，直接涂片鏡檢法的敏感性不及分離培養法。
2．分離培養 有很多種類(lèi)的細菌在形態(tài)、排列方式和染色性上不能區分，需進(jìn)行細菌的分離培養，這是確診細菌感染性疾病最可靠的方法（金標準），并有助于選用抗菌藥物及評價(jià)療效。由于各種細菌的生物學(xué)特性有所差異，所采用的培養基和培養方法也不盡相同。
從無(wú)菌部位采取的血液、腦脊液等標本，可直接接種至營(yíng)養豐富的液體或固體培養基；從正常菌群存在部位采取的標本，應接種至選擇或鑒別培養基。接種后置37℃孵育，一般需氧菌經(jīng)16～20小時(shí)大多可形成菌落（colony），厭氧菌和微需氧菌通常需2～3天才形成菌落。少數菌如布氏菌、結核分枝桿菌生長(cháng)緩慢，分別需培養3～4周和4～8周才長(cháng)成可見(jiàn)菌落。根據細菌所需要的營(yíng)養、生長(cháng)條件、菌落特征可作初步鑒別，確診還需對純培養物進(jìn)行形態(tài)特征、生化試驗和血清學(xué)試驗鑒定。分離培養法的陽(yáng)性率要比直接涂片鏡檢高，但需時(shí)較久。因此，遇白喉、氣性壞疽等急性傳染病時(shí)，可根據患者臨床表現和直接涂片鏡檢結果作出初步診斷并及時(shí)治療，不必等待分離培養報告，以免貽誤治療時(shí)間。
3．生化試驗 細菌的代謝活動(dòng)依靠一系列酶的催化作用。不同細菌具有不同的酶系，對營(yíng)養物質(zhì)的分解能力及其代謝產(chǎn)物不盡相同。檢測細菌對各種基質(zhì)（如糖類(lèi)和蛋白質(zhì)）的代謝作用和代謝產(chǎn)物的差異，借以區別和鑒定細菌，稱(chēng)之為細菌的生化試驗（biochemical testing）。例如幽門(mén)螺桿菌產(chǎn)生極強的尿素酶，可分解尿素產(chǎn)生氨，使培養液呈堿性，pH指示劑則改變顏色。生化試驗對菌體形態(tài)、革蘭染色反應和菌落特征相同或相似的細菌（如腸道桿菌）的鑒定尤為重要。
現代臨床細菌學(xué)已普遍采用微量、快速、半自動(dòng)化或自動(dòng)化的細菌生化鑒定和細菌藥敏分析系統，使細菌檢出水平明顯提高，所需時(shí)間大為縮短，推進(jìn)了相關(guān)標本鑒定的準確性與時(shí)效性。其中，VITEK-AMS系統可鑒定細菌和真菌200～300多種及近100種不同抗菌藥物的敏感性測試。細菌鑒定原理是根據不同細菌的理化性質(zhì)不同，采用光電比色法，測定細菌分解底物導致pH改變而產(chǎn)生的不同顏色，來(lái)判斷反應的結果。
4．血清學(xué)試驗 在許多情況下，難以從患者的臨床標本中分離出致病菌，特別是在發(fā)病早期已用抗生素等藥物治療過(guò)的患者，因致病菌的生長(cháng)被抑制或殺死，可明顯影響致病菌的檢出率。但是，采用血清學(xué)試驗（serological testing），即用含有已知的特異性抗體的免疫血清，可快速、準確地檢出臨床標本中極微量的致病菌特異抗原，亦可鑒定分離培養出的未知純種細菌，并可確定致病菌的種或型，有助于確定病因。常用方法有凝集試驗（如玻片凝集試驗、協(xié)同凝集試驗、乳膠凝集試驗、反向間接血凝試驗）、免疫熒光技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）等。
5．動(dòng)物試驗 利用動(dòng)物實(shí)驗，可進(jìn)行致病菌的分離與鑒定、細菌毒力的檢測等。常用實(shí)驗動(dòng)物有小鼠、豚鼠和家兔等。應根據實(shí)驗目的，選用一定體重或年齡的高度易感性的健康動(dòng)物。接種途徑有注射（皮內、皮下、腹腔、肌肉、靜脈、腦內）和灌胃等。接種后應仔細觀(guān)察動(dòng)物的食量、精神狀態(tài)和局部變化等。若動(dòng)物出現特有的癥狀或死亡，應立即解剖，檢查病變，或作細菌分離培養，證實(shí)由何種致病菌所致。動(dòng)物實(shí)驗一般不作為常規細菌學(xué)診斷。
6．基因診斷技術(shù) 核酸雜交和PCR技術(shù)不需分離培養，只需檢測標本中致病菌的特異性核酸片段，即可鑒定出致病菌，具有特異性強、敏感度高、快速等特點(diǎn)，尤其適用于檢測難以或不能培養的致病菌（如梅毒螺旋體），以及培養時(shí)間較長(cháng)或培養條件苛刻的致病菌（如立克次體、衣原體、結核分枝桿菌、幽門(mén)螺桿菌、空腸彎曲菌、嗜肺軍團菌和無(wú)芽胞厭氧菌等）。
（1）核酸雜交技術(shù)：原理是應用放射性核素或生物素、地高辛、辣根過(guò)氧化物酶、熒光素等非放射性物質(zhì)標記的已知序列單鏈核酸（如16SrRNA編碼基因中的保守序列）作為探針（probe），在一定條件下，根據堿基配對原則，與待測標本的同源或部分同源核酸單鏈退火，形成雙鏈雜交體。然后，通過(guò)雜交信號的檢測，鑒定臨床標本（如血清、尿、糞便或活檢組織）中有無(wú)相應的病原體特異基因。
核酸雜交過(guò)程可在溶液中進(jìn)行（液相雜交），也可使探針DNA結合到固相載體（如硝酸纖維膜）上，或使組織中DNA雙鏈打開(kāi)，然后進(jìn)行雜交（固相雜交）。固相核酸雜交較為常用，有原位雜交（in situ hybridization）、斑點(diǎn)雜交（dot blot）、Southern印跡、Northern印跡等。核酸雜交可直接檢出標本中的致病菌，不受標本中的雜質(zhì)干擾，對尚不能或難分離培養的致病菌尤為適用，亦可同時(shí)檢出多種致病菌。
（2）PCR技術(shù)：是一種體外擴增特異性DNA片段的技術(shù)，具有快速、靈敏度高和特異性強等特點(diǎn)。其基本步驟是，從標本中提取DNA作為擴增模板，選用一對人工合成的特異寡核苷酸作為引物，在熱穩定DNA聚合酶作用下，經(jīng)不同溫度的變性、退火、延伸，多次循環(huán)后，即可在數小時(shí)內獲得數百萬(wàn)個(gè)特異性DNA序列的拷貝。擴增產(chǎn)物作瓊脂糖凝膠電泳和溴乙錠染色后，即可確定要擴增的目的DNA存在與否。若需進(jìn)一步鑒定，可從凝膠中分離和回收PCR產(chǎn)物，再用標記的特異探針確定，或直接測序分析。目前，PCR技術(shù)和由此發(fā)展而來(lái)的逆轉錄PCR（reverse transcriptase PCR, RT-PCR）、定量實(shí)時(shí)熒光PCR（real-time PCR）等技術(shù)已廣泛用于感染性疾病的基因診斷。
（3）DNA芯片（DNA array）技術(shù)：又稱(chēng)基因芯片（gene chip）技術(shù)，由核酸雜交技術(shù)衍生而來(lái)。其基本原理是：首先，將大量的特異寡核苷酸探針有序地、高密度地點(diǎn)布并固定在硅片、玻片等固相支持物上，組成DNA微點(diǎn)陣（microarray），即DNA芯片；然后，抽提待檢樣本中的DNA或mRNA，用熒光染料標記后，與DNA芯片上的探針雜交，應用激光共聚焦顯微掃描技術(shù)，記錄雜交結果；最后，應用分析軟件，對雜交位點(diǎn)及其信號強弱進(jìn)行分析，找出差異表達的基因，判別標本中的特異性致病菌。應用致病菌基因組、耐藥基因、毒力基因等重要基因的芯片，通過(guò)單一雜交即可完成致病菌的基因分型與菌種鑒定、耐藥性快速診斷、致病菌與非致病菌鑒定等，為臨床治療提供可靠的理論依據。該技術(shù)可將許多不同類(lèi)型的探針同時(shí)固定于一張芯片上，一次可對樣品中可能存在的多種致病菌進(jìn)行系統檢測分析。
