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【關(guān)鍵詞】 微生物藥物
MBS是指抗生素產(chǎn)生菌經(jīng)過(guò)物理、化學(xué)等誘變因素的作用或通過(guò)基因改造，生物合成途徑中的某一位點(diǎn)發(fā)生突變，喪失合成完整抗生素分子的能力而成為阻斷突變株。在發(fā)酵培養這種阻斷突變株時(shí)，添加某種天然的或化學(xué)合成的化合物——突變合成元（muta- synthon）參與生物合成并獲得新抗生素的方法和過(guò)程。廣義的MBS還包括利用生物合成途徑改變獲得原抗生素的代謝產(chǎn)物和利用阻斷突變株積累一些原始菌株所不能積累的抗生素中間體。
1969年，Shier用MBS方法對新霉素進(jìn)行結構改造。1975年，Nagaoka等用“idiotroph”——獨需型（特需型）來(lái)描繪那些需要加入外源前體完成新衍生物合成的突變株，并用“mutational biosynthesis”——突變生物合成來(lái)描繪這種技術(shù)。1977年Rinehart將這種技術(shù)定義為“mutasysthesis”。按照Rinehart的解釋?zhuān)?/SPAN>MBS技術(shù)制備新衍生物應包括:①突變株的獲得;②突變合成元的獲得;③添加的突變合成元被細胞吸收并參與新衍生物合成。此外，后續工作還應包括新衍生物的分離和結構鑒定，以及生物活性評價(jià)。
本文按結構類(lèi)別介紹MBS技術(shù)在微生物藥物領(lǐng)域的研究應用，特別是近年來(lái)結合基因技術(shù)進(jìn)行MBS研究的新進(jìn)展。
1 突變生物合成在氨基糖苷類(lèi)抗生素中的應用1～5］
氨基糖苷類(lèi)抗生素是臨床上重要的抗感染藥物，但存在一定程度的腎、耳毒性。因此，對已有品種進(jìn)行改造，開(kāi)發(fā)對耐藥菌有效、腎（耳）毒性相對較小的新品種一直是新藥研究人員追尋的目標。20世紀70年代，人們利用MBS技術(shù)對氨基糖苷類(lèi)抗生素進(jìn)行改造，獲得成功，特別是涉及2-脫氧鏈霉胺（2-deoxystrepta-mine，DOS）獨需型阻斷突變株的研究。如Rosi等通過(guò)誘變獲得慶大霉素產(chǎn)生菌絳紅色小單孢菌（Micromo-nospora purpurea）D-突變株后，添加鏈霉胺，生成2-羥基-慶大霉素，該化合物對含有2”-腺苷腺化酶的慶大霉素耐藥菌有較強活性，毒性低，在臨床上被廣泛使用。這方面的研究Rinehart等曾進(jìn)行過(guò)總結，本文不做詳細敘述。
值得提出的是，20世紀80年代趙敏等通過(guò)誘變獲得a位點(diǎn)（Fig.1）阻斷的突變株JIM-401，該突變株代謝產(chǎn)物中慶大霉素C 2b （GM C2b ）組分即小諾米星的產(chǎn)量大大提高，并實(shí)現工業(yè)化生產(chǎn);再以JIM-401為出發(fā)菌株，獲得c位點(diǎn)阻斷的突變株JIM-202，該突變株的代謝產(chǎn)物中慶大霉素C1a （GM C 1a ）的積累量大大增加（含量在85%以上），在其2-脫氧鏈霉胺1-N位引入一個(gè)乙基，經(jīng)半合成獲得新化合物1-N-乙基慶大霉素C1a （etimicin，依替米星）;再以JIM-202為出發(fā)菌 株，獲得b位點(diǎn)阻斷的突變株JIM121，其代謝產(chǎn)物中 西索米星（sisomicin）組分的產(chǎn)量大大增加。
目前，丁酰苷菌素、卡那霉素、慶大霉素、妥布霉素、新霉素、鏈霉素等氨基糖苷類(lèi)抗生素的生物合成基因簇的研究取得了可喜的成就，這為利用MBS方法結合現代基因技術(shù)對氨基糖苷類(lèi)抗生素進(jìn)行改造提供了有利條件。
2 核苷類(lèi)抗生素的MBS研究［6，7］
Nikkomycin是唐德鏈霉菌（Streptomyces tendae）Tü901產(chǎn)生的一種核苷肽類(lèi)抗生素，與幾丁質(zhì)合成酶底物UDP-N-乙酰葡萄糖胺有類(lèi)似結構，競爭性抑制幾丁質(zhì)合成酶，干擾真菌細胞壁的合成，是一種低毒的抗真菌及殺蟲(chóng)劑。
尿嘧啶和4-甲�；�-4-咪唑啉-2-酮是nikkomycin生物合成途徑中的兩個(gè)中間體，分別對應Z和X組分。1984年，Delzer等通過(guò)誘變獲得pyr - 突變株。該突變株不能合成以尿嘧啶為中間體的nikkomycin。添加23種N-雜環(huán)化合物進(jìn)行MBS研究，其中胸腺嘧啶、5-羥甲基尿嘧啶和5-氟尿嘧啶可被利用合成新的衍生物。
1999年，Bormann等采用基因工程方法進(jìn)行MBS的研究，構建了L-賴(lài)氨酸-2-氨基轉移酶失活突變株S.tendae nikC，該突變株不能合成nikkomycin I，J，X，Z肽基側鏈的前體哌啶-2-羧酸，積累了nikkomycin的核苷成分。當添加吡啶甲酸時(shí)，可恢復產(chǎn)生nikkomycin I，J，X，Z;添加苯甲酸，獲得Bx和Bz組分（如Fig.2所示）。Bx和Bz比X，Z有較高的pH穩定性，Bx對白念珠菌有更高的抑菌活性。
此外，Bormann等還構建了產(chǎn)nikkomycin LX 和L 的突變株，獲得的新衍生物也顯示出很好的抗菌活性。目前，nikkomycin產(chǎn)生菌分子生物學(xué)特性的研究已經(jīng)取得了巨大的成就，通過(guò)MBS技術(shù)并結合基因手段，相信會(huì )有更多更優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品出現。
3 Clorobiocin的MBS研究［8，9］
Clorobiocin、新生霉素（novobiocin）和coumer-mycin（香豆霉素）是由鏈霉菌產(chǎn)生的一類(lèi)具有抑制 DNA旋轉酶活性的抗生素，同屬于氨基香豆素家族，
Fig.2 MBS of nikkomycin 能夠與細菌DNA旋轉酶B亞基緊密結合，有效抑制該酶活性，實(shí)現抗菌作用。對氨基香豆素類(lèi)抗生素的研究主要集中在clorobiocin和新生霉素，兩者的結構如Fig.3所示，包括三個(gè)部分:ring A，3-異戊烯基-4-羥基-苯甲酰（3-prenyl-4-hydroxybenzoyl，DMAHB）;ring B，3-氨基-4，7-二羥基香豆素（3-amino-4，7-dihy-droxycoumarin，ADHC）;ring C，諾維糖（L-noviose）。2004年Galm等通過(guò)基因手段構建了clorobiocin產(chǎn)生菌異戊烯基轉移酶失活突變株——cloQ - 。該突變株不能合成DMAHB前體。添加DMAHB類(lèi)似物（如Fig.4所示）獲得了28種clorobiocin衍生物。體外活性研究發(fā)現，新衍生物對大腸埃希菌DNA旋轉酶抑制活性是新生霉素的50%～200%，但即使是活性最高的衍生物，其活性?xún)H為clorobiocin的50%;對枯草芽孢桿菌ATCC14893的生長(cháng)抑制活性比新生霉素和clorobiocin都低;大部分新衍生物對葡萄球菌均有效。
4 糖肽類(lèi)抗生素的MBS研究
活性與萬(wàn)古霉素相當，但對厭氧菌尤其是梭狀芽孢桿菌的抑制活性要高得多。因此，balhimycin具有很好的臨床價(jià)值。
目前，對balhimycin等糖肽類(lèi)抗生素的結構改造研究主要集中在非蛋白組成氨基酸，如β-羥基酪氨酸（Hty）、3，5-二羥基苯基甘氨酸（Dpg）和4-羥基苯基甘氨酸（Hpg）等。
2002年，Pek等第一次用MBS技術(shù)對balhimycin進(jìn)行研究（Fig.6a），刪除過(guò)氧化氫酶基因bhp的一段序列，獲得Hty合成阻斷突變株。添加Hty，修復bal-himycin生產(chǎn)能力;添加外消旋3-氟-β-羥基酪氨酸合成了fluorobalhimycin;添加2-氟，3，5-二氟-β-羥基酪氨酸也合成了相應的fluorobalhimycins;D/L-酪氨酸以及酪氨酸酚羥基被氟取代或位置改變的類(lèi)似物，未能摻入到新衍生物的合成，說(shuō)明酚羥基的重要性�；钚匝芯勘砻�，所有的氟化balhimycin衍生物對枯草芽孢桿菌都有抑制活性。
2004年，Weist等刪除Dpg編碼基因dpgA的一段序列，獲得Dpg合成阻斷突變株。添加Dpg，修復balhimycin生產(chǎn)能力;添加4種單、雙取代羥基、甲氧基的Dpg類(lèi)似物（Fig.6b）均獲得了新衍生物;通過(guò)添加實(shí)驗，Weist等共獲得20多種糖基化方式不同的衍生物。有趣的是，添加3-單取代-苯基甘氨酸，合成的新衍生物有一部分在7位Dpg和5位Hpg間缺少正常balhimycin的AB-環(huán)聯(lián)芳鍵。 CDA CDA（calcium-dependent antibiotic）是由天藍色鏈霉菌（Streptomyces coelicolor）A3產(chǎn)生的酸性脂肽類(lèi)抗生素，其結構與達托霉素（daptomycin）類(lèi)似，分子中有許多D-氨基酸和非蛋白組成氨基酸，與免疫抑制劑環(huán)孢菌素、抗腫瘤藥物博來(lái)霉素和抗菌藥物萬(wàn)古霉素同屬于非核糖體合成肽（nonribosomal peptides）家族。CDA的結構如Fig.7所示，根據R 6 、R 9 、R10 和R 11 上取代基的不同，分為CD A 1b 、CD A 2b 、CD A 3b 、CD A4b 、CD A 2a 、CD A 4a 等組分。英國曼徹斯特理工 大學(xué)（UMIST）和Sanger研究所對CDA基因簇結構研究結果顯示，82Kb的基因簇序列包含了至少40個(gè)開(kāi)放閱讀框（SCO3210-SCO3249），并利用分子手段結合現代分離檢測技術(shù)對各閱讀框的功能和CDA的生物合成途徑進(jìn)行了研究和推理。
2002年，Hojati等利用分子生物學(xué)手段獲得4-羥基-苯乙醇酸合成酶基因hmaS（SCO3229）被破壞的突變株，該突變株不能合成CDA分子重要的結構單元4-羥基-苯基甘氨酸（Hpg）。添加外消旋4-羥基-苯乙醇酸或4-羥基-苯乙醛酸或L-Hpg可恢復CDA的生產(chǎn)能力;添加苯乙醇酸、苯乙醛酸、苯酰甘氨酸類(lèi)似物（脫羥基或羥基被鹵元素取代），獲得了芳香側鏈4位羥基被H取代的衍生物CDA 2d 和被F取代的 R6 R 9 R10 R11 CAD1b OH OPO3 H2 H H-H CAD 2a OH OPO3 H2 CH 3 π-bond CAD2b OH OPO 3 H2 CH3 H-H CAD3a OH OH H π-bond CAD3b OH OH H H-H CAD 4a OH OH CH 3 π-bond CAD4b OH OH CH3 H-H CAD2d H OPO3 H2 CH3 H-H CAD1ta F OPO 3 H 2 CH 3 π-bond CDA 2td F OPO3 H 2 CH3 H-H Fig.7 Structure of CDA analoguesCDA 2fd ;而添加4-氯苯乙醛酸以及含對氯和對甲氧基的類(lèi)似物，均未得到類(lèi)似CDA2fd 的衍生物。
