吡咯類(lèi)抗真菌藥物制劑微生物限度檢查方法的研究

    [摘要] 目的：研究建立吡咯類(lèi)抗真菌藥物制劑的微生物限度檢查方法。方法：通過(guò)預試驗摸索，擬以含有組氨酸、卵磷脂和聚山梨酯80的混合溶液作為稀釋劑及沖洗液，采用離心沉淀集菌法與薄膜過(guò)濾法聯(lián)用的方法進(jìn)行此類(lèi)藥物的微生物限度檢查并進(jìn)行方法學(xué)驗證。結果：按《中國藥典》2005年版附錄要求對擬定方法進(jìn)行驗證，結果驗證菌株的回收率均大于70%，控制菌檢查陽(yáng)性菌也生長(cháng)良好。結論：以含有組氨酸、卵磷脂和聚山梨酯80的混合溶液作為稀釋劑及沖洗液，采用離心沉淀集菌法與薄膜過(guò)濾法聯(lián)用進(jìn)行吡咯類(lèi)抗真菌藥物制劑的微生物限度檢查，方法是可行的。

　　[關(guān)鍵詞] 吡咯類(lèi)抗真菌藥物制劑；微生物限度檢查；離心集菌法；薄膜過(guò)濾法

　　[Abstract] Objective：To establish a method of microbial limit test on the antifungal drug of piromidic. Methods：According to the result of test beforehand, we used the histidine,lecithin,Tween 80 mixed solution as the diluent and lotion. The methods of contrifugal precipitation and membrance filtration were used for collecting bacteria and validation of microbiological test. Results: The ratio of recoveries of five germs were bigger than 70%, and the requirement of the Pharmacoeia of China (ChP) 2005 were reached. Conclusion: The method is suitable to the microbial limit test for the antifungal drug of piromidic.

　　[Key words] Antifungal drug of piromidic;Validation of microbiological test; Centrifugal precipitation; Membrane filtration methods

　　吡咯類(lèi)抗真菌藥，如硝酸布康唑和克霉唑，具廣譜抗真菌活性，對表皮癬菌、毛發(fā)癬菌、曲菌、著(zhù)色真菌、隱球菌屬和念珠菌屬均有較好的抗菌活性。該類(lèi)藥物通過(guò)干擾細胞色素P-450的活性，從而抑制真菌細胞膜主要固醇類(lèi)-麥角固醇的生物合成，損傷真菌細胞膜并改變其通透性，導致重要的細胞內物質(zhì)外漏，還可抑制真菌的三酰甘油和磷脂的生物合成，抑制氧化酶和過(guò)氧化酶的活性，引起細胞內過(guò)氧化氫積聚，導致細胞亞微結構變性和細胞壞死。此類(lèi)藥物對細菌也有一定的抑制作用。根據目前國內要求，非規定滅菌的藥物制劑均需建立微生物限度檢查方法，包括抗細菌和抗真菌類(lèi)藥物制劑，但由于此類(lèi)藥物抗菌活性很強，因此如何消除其抑菌性，使檢驗得以順利進(jìn)行就成為建立方法時(shí)極為重要也是較為困難的關(guān)鍵點(diǎn)。本文作者選擇目前在國內還沒(méi)有適宜微生物限度檢查方法的吡咯類(lèi)（如硝酸布康唑和克霉唑）抗真菌藥物制劑進(jìn)行了試驗研究，經(jīng)多次試驗，重點(diǎn)對沖洗液組成和沖洗量進(jìn)行考察研究和優(yōu)選，最終參考《歐洲藥典》確定了以含有組氨酸、卵磷脂和聚山梨酯80的混合溶液作為稀釋劑及沖洗液，采用離心沉淀集菌法與薄膜過(guò)濾法聯(lián)用，從而建立了硝酸布康唑類(lèi)和克霉唑類(lèi)藥物制劑的微生物限度檢查方法，并進(jìn)行了方法學(xué)驗證，結果表明該方法是適宜可行的。

　　1試藥與儀器

　　1.1試藥

　　硝酸布康唑陰道乳膏3批，克霉唑陰道片2個(gè)廠(chǎng)家各3批，復方克霉唑乳膏3批，克霉唑乳膏3批，醋酸米康唑乳膏3批，均為市售藥品；營(yíng)養肉湯培養基，改良馬丁培養基，營(yíng)養瓊脂培養基，玫瑰紅鈉瓊脂培養基，膽鹽乳糖培養基，溴化十六烷基三甲胺瓊脂培養基，甘露醇氯化鈉瓊脂培養基，均購自中國藥品生物制品檢定所；組氨酸、卵磷脂、聚山梨酯80、蛋白胨、氯化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉均為市售分析純試劑、試藥；金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]，枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]，大腸埃希菌[CMCC(B)44102]，銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]，白色念珠菌[CMCC(F)98001]，黑曲霉[CMCC(F)98003]，以上菌種均購自中國藥品生物制品檢定所菌種室，按照《中國藥典》2005年版附錄的要求將以上5種驗證菌配制成每1 ml中含菌量為50~100 cfu的菌液。

　　1.2儀器

　　潔凈工作臺，醫用吸引器，低速離心機等。

　　2方法與結果

　　2.1藥典附錄收載方法試驗的結果

　　將上述各藥品用《中國藥典》2005年版推薦的常用稀釋劑pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成1∶10的供試液，依次采用藥典附錄收載的幾種消除藥物抑菌性的處理方式，即培養基稀釋法（取1∶10的供試液按每皿0.2 ml或取1∶100的供試液按每皿0.2 ml注皿）、離心沉淀集菌法和以pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液為沖洗液的薄膜過(guò)濾法、以及將離心沉淀集菌法與薄膜過(guò)濾法聯(lián)用進(jìn)行菌落計數試驗。其中，以pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液為沖洗液，沖洗總量已達1 000 ml的離心沉淀集菌法與薄膜過(guò)濾法聯(lián)用試驗回收率測定結果見(jiàn)表1。

　2.2回收率測定

　　即使采用了處理力度較大的離心沉淀集菌法與薄膜過(guò)濾法聯(lián)用，５種驗證菌株中仍有4種回收率為零，說(shuō)明吡咯類(lèi)抗真菌藥物具有很強的抑制細菌和真菌的作用，或說(shuō)明濾膜對此類(lèi)藥物有較強的吸附作用，目前常用的沖洗液很難將其沖洗干凈，國內常用的幾種處理方式均不適用于此類(lèi)藥品。

　　2.3不同配方稀釋劑與沖洗液的效果比較

　　參考《中國藥典》2005年版[1]、《歐洲藥典》第5版[2]，配制了下列5種稀釋劑與沖洗液，詳見(jiàn)表2。

選用一批克霉唑陰道片，依次試驗上述5種稀釋劑與沖洗液，采用離心沉淀集菌法與薄膜過(guò)濾法聯(lián)用，比較實(shí)驗效果，詳見(jiàn)表3。

上述結果表明，采用歐洲藥典配方溶液且卵磷脂為進(jìn)口試劑，或采用自擬5號溶液作為稀釋劑與沖洗液均對消除藥品的抑菌性效果較為滿(mǎn)意，但當卵磷脂改為國產(chǎn)試劑時(shí)，由于溶液呈混濁狀，無(wú)法進(jìn)行過(guò)濾。將卵磷脂和聚山梨酯80的量降為歐洲藥典配方量的一半時(shí)，溶液澄清度可不受試劑質(zhì)量影響，同時(shí)沖洗效果也可滿(mǎn)足實(shí)驗要求。2.4建立的方法

　　2.4.1根據上述試驗結果建立方法取供試品10 g，加入含有無(wú)菌組氨酸-卵磷脂-聚山梨酯80的混合溶液（配制方法見(jiàn)后）至100 ml，在45℃保溫振搖至供試品分散均勻，制成1∶10的均勻供試品儲備液。細菌計數、霉菌和酵母菌計數均采用離心沉淀集菌法與薄膜過(guò)濾法聯(lián)用。取1∶10的供試品儲備液50 ml，以500 r/min的速率離心5 min，取全部上清液，加上述混合溶液至50 ml，再以3 000 r/min的速率離心20 min，取底部集菌液約5 ml，加上述混合溶液至50 ml，即為1∶10的供試液（乳膏等制劑可略去沉淀步驟）。取1∶10的供試液1 ml，加至上述混合溶液100 ml中，用薄膜過(guò)濾器全部過(guò)濾，以上述混合溶液作為沖洗液，每次沖洗100 ml，共沖洗3次，取濾膜，依法檢查（《中國藥典》2005年版二部附錄Ⅺ J）。

　　2.4.2控制菌檢查（如金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌等）采用離心沉淀集菌法與薄膜過(guò)濾法聯(lián)用。取上述菌落計數項下1∶10的供試液10 ml，加至上述混合溶液100 ml中，用薄膜過(guò)濾器全部過(guò)濾，沖洗方式同菌落計數項下，將濾膜接種至相應的培養基中，依法檢查(《中國藥典》2005年版二部附錄Ⅺ J)。

　　2.4.3無(wú)菌組氨酸－卵磷脂－聚山梨酯80混合溶液配制方法聚山梨酯80 15 g，卵磷脂1.5 g，組氨酸0.5 g，蛋白胨0.5 g，氯化鈉2.15 g，磷酸二氫鉀1.8 g，磷酸氫二鈉3.6 g，水1 000 ml，混勻，微溫溶解，分裝，滅菌。

　　2.5驗證試驗

　　按照《中國藥典》2005年版附錄要求對上述建立的方法進(jìn)行驗證。

　　2.5.1細菌計數、霉菌和酵母菌計數方法的驗證菌液組：分別取上述5種菌液各1 ml，采用平皿計數法，測定制備好的菌液中每毫升的活菌數。供試品對照組：取1∶10的供試液1 ml，加入上述混合溶液100 ml，用薄膜過(guò)濾器全部過(guò)濾，沖洗方式同上，取濾膜，置規定溫度培養、計數。試驗組：取1∶10的供試液1 ml，按供試品對照組同法操作，在第三次沖洗液中加入1 ml上述菌液（50~100 cfu試驗菌），取濾膜，置規定溫度培養、計數，計算回收率，見(jiàn)表4。稀釋劑對照組：分別取上述5種菌液各10 ml（500~1 000 cfu試驗菌），按供試品對照組同法操作，計算回收率，見(jiàn)表4。按下列公式計算回收率(%)：

　　上述實(shí)驗顯示，各驗證菌的回收率均達到藥典附錄要求，表明該類(lèi)藥品采用此法進(jìn)行細菌、霉菌和酵母菌計數是可行的。

　　2.5.2控制菌檢查方法的驗證試驗組：取上述1∶10的供試液10 ml，加至上述混合溶液100 ml中，用薄膜過(guò)濾器全部過(guò)濾，沖洗方式同上，將濾膜加至相應培養基100 ml中進(jìn)行增菌培養，作為供試品組�？瞻讓φ战M：取上述混合溶液10 ml，同法操作，作為稀釋劑空白對照組。陰性菌對照組：取1∶10的供試液10 ml，加至上述混合溶液100 ml中，用薄膜過(guò)濾器全部過(guò)濾，沖洗方式同上，但在第3次沖洗液中加入適宜的陰性對照菌（如金黃色葡萄球菌檢查就選用大腸埃希菌作為陰性對照菌）10~100 cfu，將濾膜加至相應培養基100 ml中作為陰性菌對照組。陽(yáng)性菌對照組：取1∶10的供試液10 ml，加至上述混合溶液100 ml中，用薄膜過(guò)濾器全部過(guò)濾，沖洗方式同上，但在第3次沖洗液中加適宜的菌（如金黃色葡萄球菌檢查就加入金黃色葡萄球菌）10~100 cfu，將濾膜加至相應培養基100 ml中作為陽(yáng)性菌對照組。

　　上述各組均置35～37℃培養18～24 h，分別劃線(xiàn)于相應培養基上，再置35～37℃培養18～24 h，結果陽(yáng)性菌對照組均生長(cháng)良好，表明該類(lèi)藥物經(jīng)此法處理后已無(wú)抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計；陰性菌均未檢出，表明該控制菌檢查方法的專(zhuān)屬性好，說(shuō)明方法可行。

　　3討論

　　本實(shí)驗研究說(shuō)明吡咯類(lèi)藥物對細菌和真菌同時(shí)具有很強的抑菌作用，對于這類(lèi)具有較強抗菌活性的藥物必須首先摸索處理方式來(lái)消除其抑菌作用，然后方能順利進(jìn)行其微生物限度檢查。

　　若采用薄膜過(guò)濾法進(jìn)行藥品的微生物限度檢查，選用的稀釋液和沖洗液的種類(lèi)和用量非常重要，甚至可以決定方法的適用與否。作為微生物限度檢查用稀釋液和沖洗液，不單應具有溶解藥物的功能，同時(shí)還應具有維持菌體細胞膜的通透性、修復受損細胞、破壞藥物對菌體細胞損傷等作用。本實(shí)驗確定的沖洗液的處方中組氨酸是白色念珠菌生長(cháng)中重要的氮源之一；卵磷脂對于細胞膜的修復可起到重要的作用；聚山梨酯80作為一種表面活性劑，可降低細菌體周?chē)�與培養基接觸面之間的表面張力，使外圍營(yíng)養物質(zhì)更快地進(jìn)入細胞內，因而促進(jìn)細菌較快的生長(cháng)和其他活動(dòng)。卵磷脂和聚山梨酯80配合使用可中和抑菌劑，中和后的產(chǎn)物對細菌及培養基無(wú)太大影響，因此在稀釋液和沖洗液中加入這些物質(zhì)可有效的降低藥品對細菌和真菌的抑制作用，同時(shí)促進(jìn)受損的細菌和真菌生長(cháng)。

　　某些國產(chǎn)試劑、試藥與進(jìn)口品存在一定的質(zhì)量差異，《歐洲藥典》收載的沖洗液配方中卵磷脂及聚山梨酯80的含量較多，當用國產(chǎn)品配制時(shí)，其溶解性能不好，造成溶液混濁，沖洗量大時(shí)，溶液過(guò)濾的速度緩慢，影響沖洗效果，甚至無(wú)法進(jìn)行過(guò)濾。該問(wèn)題通過(guò)降低配方中各成分的量可以得到有效解決。經(jīng)驗證，即使配方中的各成分量減少一半，效果依然可滿(mǎn)足實(shí)驗的需要，且過(guò)濾速度適宜，還可降低實(shí)驗成本。

作者：劉文杰　江志杰　余　立　高　春　王似錦

[參考文獻]

[1]國家藥典委員會(huì ).中國藥典[S].二部.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005. 附錄93.

[2]歐洲藥典[S].第5版.Appendix XVI B.A377.

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