禽流感病毒檢測方法

縮寫(xiě)：

AI - 禽流感

PCR - 聚合酶鏈式反應

RT-PCR - 反轉錄聚合酶鏈式反應

NASBA - 核酸序列擴增

ATCC - 美國菌種保藏中心

PLA - 接近黏合法

NP - 納米粒子

fM - femtomolar毫微微摩爾

TCID₅₀ - 組織培養感染劑量中位數

    高致病性禽流感病毒（AI）由于人畜共患傳染而成為現在對公眾健康構成重大威脅的病毒。它給衛生服務(wù)帶來(lái)了額外的負擔，并且由于禽類(lèi)患病而影響企業(yè)利益，而這最終會(huì )給國家和世界的經(jīng)濟帶來(lái)負面影響。最近由于高致病性禽流感病毒AI而引起的野生鳥(niǎo)類(lèi)和養殖家禽禽流感的重新爆發(fā)表明我們迫切需要快速、敏感的檢測方法。迄今為止，基于PCR和抗原的檢測禽流感病毒的方法是用的最多的方法。另外，基于核酸擴增的方法也在開(kāi)發(fā)以希望能提高靈敏度和特異性，這就是核酸序列擴增和基因芯片技術(shù)。

    PCR 和 RT-PCR

    基于PCR的檢測技術(shù)是禽流感診斷中最常用的方法。傳統的反轉錄PCR（RT-PCR）和實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法常用于識別禽流感病毒毒株。實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)在診斷方面的應用比傳統的反轉錄PCR方法更具優(yōu)勢。其優(yōu)點(diǎn)包括以下3個(gè)方面但又不僅局限于此：

• 降低了由于缺乏后續處理技術(shù)而導致PCR擴增產(chǎn)物轉接的風(fēng)險；
• 更高的精度與更短的周轉時(shí)間相結合提高了吞吐能力；
• 自動(dòng)化。

    現在已經(jīng)報道了許多基于實(shí)時(shí)定量PCR的診斷方法，例如霍夫曼等人就在2007年報道了一種診斷方法可以快速、特異的診斷青海血統的HPAIV病毒H5N1毒株，因為它結合了一個(gè)裂解位點(diǎn)，不用測序就可直接分析。

    最近，Muradrasoli等（2010）報道了一種以測定人和動(dòng)物的A、B 和 C三種流感病毒核蛋白基因為目標的三重熒光實(shí)時(shí)定量PCR方法研究進(jìn)展。此法利用了一種新型不匹配容錯分子信標，同時(shí)也是熒光定量的探針，它可以允許在探針測定范圍內的核苷酸變異。當檢測各種樣品時(shí)，這種方法比熒光探針PCR表現了更高的敏感性。與熒光探針PCR相比，這種方法能檢測到病毒總RNA或者總cDNA的十分之一的樣品�？偟膩�(lái)說(shuō)，由于具有簡(jiǎn)單性和可靠性等特點(diǎn)基于反轉錄PCR的方法已經(jīng)成為目前主要的診斷方法。最近Schlingemann等（2010）報道了一種可在生物樣本中檢測病毒抗原的PCR替換方法。PLA是一種新的方法可通過(guò)核酸擴增來(lái)檢測蛋白質(zhì)。這種方法是利用了當一些抗病原體表面蛋白抗體接近時(shí)細菌表面蛋白抗體通過(guò)連接體與DNA雙鏈相結合。它通過(guò)DNA雙鏈來(lái)測定目標蛋白，而DNA雙鏈可以在實(shí)時(shí)定量PCR中得到擴增。這種利用禽流感病毒特異性核蛋白單克隆抗體的方法與常規參考的實(shí)時(shí)定量PCR方法相比具有很高的特異性，因為它消除了提取核酸的必要性。另外，這種方法可以使用失活的樣品，這樣樣品就可以安全的從現場(chǎng)送到實(shí)驗室。雖然這是一種剛剛建立的方法，但是由于它能在復雜的生物樣品中檢測微含量的病原體蛋白而使它成為最具潛力的替代方法。

    快速可靠的檢測技術(shù)可以在早期成功的檢測到病毒。病毒的DNA序列在成功預防這種疾病過(guò)程中起到重要作用。為了實(shí)現這一目標，一種基于超級對流原理的核苷酸測序技術(shù)和快速PCR技術(shù)相聯(lián)合的方法建立起來(lái)了（Yacoub等2009年報道）。來(lái)自廣譜禽流感病毒的HA基因通過(guò)一步法實(shí)時(shí)定量PCR反應得到擴增，接下來(lái)進(jìn)行涵蓋HA基因裂解位點(diǎn)的快速測序。測定序列和病毒致病性的評估包括HA基因的序列信息，這些步驟在2小時(shí)之內都能完成。這種革新的方法被認為是在處理高通量樣本，特別是處理監測點(diǎn)現場(chǎng)樣品時(shí)，是一種低成本、高效率及實(shí)用的方法。

    NASBA方法

    檢測RNA分子的方法是反轉錄PCR（RT-PCR）。多輪熱循環(huán)后就是反轉錄反應，這樣既費時(shí)又因為轉移污染而易造成假陽(yáng)性。核酸序列擴增法（NASBA）是一種從雙鏈DNA擴增mRNA的單步等溫RNA擴增過(guò)程；這種替代方法是最近在2002年由柯林斯等人建立起來(lái)的。這種方法能在歐洲血統的血液中分離出禽流感A型H5亞型，有趣的是，柯林斯等人又在2003年設計了另一種NASBA法可以檢測禽流感病毒H7亞型。這種擴增方法在等溫下中實(shí)現并同時(shí)使用三種酶：禽類(lèi)成髓細胞血癥病毒反轉錄酶、T7 RNA聚合酶和核糖核酸酶H并結合2個(gè)特別設計的DNA寡核苷酸引物。這個(gè)擴增步驟是緊跟著(zhù)電化學(xué)發(fā)光檢測的。這個(gè)NASBA方法被證明有很高的敏感性和特異性。最近，一款用在臨床樣品的快速診斷H5N1病毒的商業(yè)化NASBA被開(kāi)發(fā)出來(lái)（摩爾等，2010）。盡管NASBA方法是快速的，但是由于在室內準備N(xiāo)ASBA混合劑的困難和商業(yè)試劑盒成本太高，這種方法并沒(méi)有得到廣泛應用。

    基因芯片技術(shù)

    基因芯片技術(shù)被證明是病毒檢測和分型最有力的一種工具。它允許同時(shí)檢測很大變異遺傳元件。舉個(gè)例子，據報道它在檢測A/H5N1, A/H3N2和A/H1N1病毒株時(shí)的臨床敏感性時(shí)95%，特異性是92%（道森等人，2007）。另外一種類(lèi)型的基因芯片，低密度基因芯片也值得一提。低密度基因芯片利用的是NanoChip400系統（Nanogen公司產(chǎn)品）， 它有一個(gè)M基因的探針和97個(gè)HA基因的裂解位點(diǎn)基因探針，它被認為是檢測H5N1病毒的一個(gè)可靠地工具（高爾等人，2009）。值得一提的是，這里提到的檢測極限可以比實(shí)時(shí)定量PCR低10到100倍。但是，上述方法所涉及的多個(gè)步驟，像一些擴增步驟，探針標記和標記的核苷酸摻入到DNA中等使得這種方法費時(shí)、費力而且價(jià)格非常昂貴。另外，引物設計的優(yōu)化和成千上萬(wàn)種探針的設計對科學(xué)家也是一種挑戰。因此，基因芯片技術(shù)排在反轉錄PCR之后。

    最近，趙等人（2010）報道了一種快速，簡(jiǎn)便的黃金納米粒子（NP）基因組PCR方法，它可以無(wú)需設計基因芯片就可特異識別禽流感病毒H5N1。它還可以區別H5N1和其他主要的流感病毒A型病毒株像H1N1 和 H3N2。這種方法使用無(wú)酶擴增捕獲目標的中間寡核苷酸雜交與黃金納米粒子（NP）介導的銀染相結合可以在2.5小時(shí)內檢測到病毒RNA。這種檢測的最低極限對純化的PCR產(chǎn)物來(lái)說(shuō)是低于100 fM，對病毒RNA是10³ TCID₅₀單位。這是一種新的方法，到目前為止還沒(méi)得到廣泛應用。

    總結

    總之，分子生物學(xué)方法有很多優(yōu)點(diǎn)，如較高的特異性和靈敏度，復合形式，能夠適應任何樣品類(lèi)型，最小的接觸傳染性樣品，快速周轉時(shí)間，和高吞吐量等優(yōu)勢。一般來(lái)說(shuō)，RT - PCR技術(shù)仍舊是用在禽流感檢測中的主要技術(shù)手段，目前，在分子生物學(xué)檢測方面，由于對技術(shù)要求水平適中、相對便宜和快速的樣品篩查等優(yōu)點(diǎn)實(shí)時(shí)定量反轉錄PCR技術(shù)成為應用最廣泛的技術(shù)。但是，禽流感檢測方法的最終選擇取決于實(shí)驗室能力和設施。上述所提所有方法的主要缺點(diǎn)是設備運行的高成本。另一個(gè)缺點(diǎn)是，所報告的方法只驗證了傳播的禽流感病毒株。為了確保足夠的效率和可靠性，所有的方法必須通過(guò)現場(chǎng)的驗證。不過(guò)，利用分子生物學(xué)技術(shù)獲得的一個(gè)陽(yáng)性結果對快速應急處理工作是很重要的，盡管這還需要病毒毒株分離工作的支持。

    引用文獻

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