農藥的微生物降解研究進(jìn)展（2）

　　1.3.2 微生物降解農藥的生化反應[10，12]

　　氧化反應  微生物體內的氧化反應包括：羥化反應（芳香族羥化、脂肪族羥化、N－羥化）；環(huán)氧化；N－氧化；P－氧化；S－氧化；氧化性脫烷基、脫鹵、脫胺。

　　還原反應  還原反應包括硝基還原、還原性脫鹵、醌類(lèi)還原等。

　　水解反應  一些酯、酰胺和硫酸酯類(lèi)農藥都有可以被微生物水解的酯鍵，如對硫磷、苯胺類(lèi)除草劑等。

　　縮合和共軛形成  縮合包括將有毒分子或一部分與另一有機化合物相結合，從而使農藥或其衍生物物失去活性。

　　應該指出，在微生物降解農藥時(shí)，其體內并不只是進(jìn)行單一的反應，多數情況下是多個(gè)反應協(xié)同作用來(lái)完成對農藥的降解過(guò)程，如好氧條件下鹵代芳烴的生物降解，其鹵素取代基的去除主要通過(guò)兩個(gè)途徑發(fā)生：在降解初期通過(guò)還原、水解或氧化去除鹵素；生產(chǎn)芳香結構產(chǎn)物后通過(guò)自發(fā)水解脫鹵或β－消去鹵化烴[6]。

　　1.4 影響微生物降解農藥的因素

　　1.4.1 微生物自身的影響

　　 微生物的種類(lèi)、代謝活性、適應性等都直接影響到對農藥的降解與轉化[21,22]。很多試驗都已經(jīng)證明，不同的微生物種類(lèi)或同一種類(lèi)的不同菌株對同一有機底物或有毒金屬的反應都不同[5，17，23，24]。另外，微生物具有較強的適應和被馴化的能力，通過(guò)一定的適應過(guò)程，新的化合物能誘導微生物產(chǎn)生相應的酶系來(lái)降解它，或通過(guò)基因突變等建立新的酶系來(lái)降解它[10]。微生物降解本身的功能特性和變化也是最重要的因素。

　　1.4.2 農藥結構的影響

　　農藥化合物的分子量、空間結構、取代基的種類(lèi)及數量等都影響到微生物對其降解的難易程度[25～28]。一般情況下，高分子化合物比低分子量化合物難降解，聚合物、復合物更能抗生物降解[10]；空間結構簡(jiǎn)單的比結構復雜的容易降解[24]。陳亞麗等 [22]在試驗中發(fā)現，凡是苯環(huán)上有－OH或－NH2的化合物都比較容易被假單胞菌WBC-3所降解，這與苯環(huán)的降解通常先羥化再開(kāi)環(huán)的原理一致。Potter等 [29]在小規模堆肥條件下研究了多環(huán)芳烴的降解后指出，2－4環(huán)的芳烴比5－6環(huán)的芳烴容易降解。

　　自然界中的微生物通�？梢越到馓烊划a(chǎn)生的有機化合物，如木質(zhì)素、纖維素物質(zhì)等，從而促進(jìn)地球的物質(zhì)循環(huán)和平衡。但目前的環(huán)境污染物大多是人工合成的自然界中本身不存在的生物異源有機物質(zhì)，其中一些是對人類(lèi)具有致畸、致突變和致癌作用，往往對微生物的降解表現出很強的抗性，其原因可能是這些化合物進(jìn)入自然界的時(shí)間比較短，單一的微生物還未進(jìn)化出降解此類(lèi)化合物的代謝機制。盡管某些危險性化合物在自然界中可能會(huì )經(jīng)自然形成的微生物群體的協(xié)同作用而緩慢降解，但這對微生物世界來(lái)說(shuō)仍然是一個(gè)新的挑戰。微生物通過(guò)改變自身的信息獲得降解某一化合物的能力的過(guò)程是緩慢的，與目前大量使用的人工合成的生物異源物質(zhì)相比，依靠微生物的自然進(jìn)化過(guò)程顯然不能滿(mǎn)足要求，因此長(cháng)期以往將會(huì )造成整個(gè)生態(tài)系統的失衡[6]。因此，研究一些可以使微生物群體在較短的時(shí)間內獲得最大降解生物異源物質(zhì)能力的方法非常重要和迫切。

　　1.4.3 環(huán)境因素的影響

　　 環(huán)境因素包括溫度、酸堿度、營(yíng)養、氧、底物濃度、表面活性劑等[10，30～33]。劉志培等 [34]研究了甲單脒降解菌的分離篩選；程國鋒等 [23]研究了微生物降解蔬菜殘留農藥；鈔亞鵬等 [15]研究了甲基營(yíng)養菌WB-1甲胺磷降解酶的產(chǎn)生和部分純化及性質(zhì)。他們所研究的微生物或其產(chǎn)生的酶系都有一個(gè)適宜的降解農藥的溫度、pH及底物濃度，這與Thomas 等 [31]、Donna Chaw 等[26]的研究結果一致。莫測輝等 [24]指出，堆肥中微生物降解多環(huán)芳烴的活性與氧的濃度和水分含量密切相關(guān)，當堆肥中氧的含量小于18%、水分含量大于75%時(shí)，堆肥就從好氧條件轉化為厭氧條件，進(jìn)而影響多環(huán)芳烴的降解效果。Hundt 等 [30]調查了biaryl化合物在土壤中和堆肥中被細菌Ralstonia和Pickettii的降解和礦化情況。在土壤水分適宜的條件下，非離子型表面活性劑吐溫80可增強微生物對biaryl類(lèi)化合物的利用率，如聯(lián)苯、4－氯聯(lián)苯。Kastner等 [35]認為，在堆肥與被多環(huán)芳烴污染的土壤混合的情況下，堆肥中有機基質(zhì)含量對于農藥降解的作用要大于堆肥中生物的含量對于農藥降解的作用；營(yíng)養對于以共代謝作用降解農藥的微生物更加重要，因為微生物在以共代謝的方式降解農藥時(shí)，并不產(chǎn)生能量，須其他的碳源和能源物質(zhì)補充能量[12]。對于好氧微生物來(lái)說(shuō)，在好氧條件下可以降解農藥，而在厭氧條件下降解效果不好；而對于厭氧微生物來(lái)說(shuō)，情況可能正相反。也有研究指出在好氧條件下，有的厭氧細菌也可以代謝一些化合物[6]。

　　1.5 農藥微生物降解的新技術(shù)和新方法

　　1.5.1 轉基因技術(shù)的應用

　　20世紀后半葉是分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)等學(xué)科迅速發(fā)展的時(shí)期，各種不同的生物學(xué)技術(shù)不斷涌現；同時(shí)在21世紀初，生物信息學(xué)、基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等新的學(xué)科迅速興起。這一切都為人工創(chuàng )造“超級農藥降解菌”提供了必要的條件。因此，利用轉基因技術(shù)進(jìn)行目的性的人工組裝“工程菌”成為有魅力的發(fā)展目標。同時(shí)，因為微生物降解農藥的本質(zhì)是酶促反應，所以，有人直接提取微生物合成的酶系來(lái)離體進(jìn)行農藥等有機化合物污染物的降解研究[15]。

　　1.5.2 多菌株復合系的構建及應用

　　以往研究農藥的生物降解偏重于用單一微生物菌株的純培養[17，23]，現在已經(jīng)證明，單一菌株的純培養效果不如混合培養。因為單個(gè)微生物不具備生物降解所需的全部酶的遺傳合成信息，而且它們在難降解化合物中馴化的時(shí)間不足以進(jìn)化出完整的代謝途徑，同時(shí)許多純培養的研究發(fā)現，在生物降解過(guò)程中會(huì )有毒性中間物質(zhì)積累，因此徹底礦化通常需要一個(gè)或一個(gè)以上的營(yíng)養菌群（如發(fā)酵－水解菌群、產(chǎn)硫菌群、產(chǎn)乙酸菌群及產(chǎn)甲烷菌群等）。一種微生物降解一部分，經(jīng)過(guò)數種微生物的接力作用和協(xié)同作用，經(jīng)過(guò)多步反應將有毒化合物完全礦化，微生物的群體作用更能抵抗生物降解中產(chǎn)生的有毒物質(zhì)[6]。筆者等利用菌種間協(xié)同關(guān)系構建的復合系不僅高效率分解木質(zhì)纖維素，而且菌種組成長(cháng)期穩定，不易被雜菌污染[36，37]，在此基礎上賦予農藥分解功能的復合系對多種農藥具有強烈的分解能力，其作用機理有待作進(jìn)一步的細致工作。關(guān)于混合培養中的微生物群落的代謝協(xié)同作用，至少可以將微生物群落分為7種：（1）提供特殊營(yíng)養物；（2）去除生長(cháng)抑制物質(zhì)；（3）改善單個(gè)微生物的基本生長(cháng)參數（條件）；（4）對底物協(xié)調利用；（5）共代謝；（6）氫（電子）轉移；（7）提供一種以上初級底物利用者[6]。另外，分子生態(tài)學(xué)技術(shù)的應用證明，目前人類(lèi)能夠分離純化的微生物種類(lèi)及其有限，甚至自然界中99%的微生物目前無(wú)法純培養[38]，因而只有培育復合系才能包含這些重要而無(wú)法純培養的微生物種類(lèi)。

2  研究中存在的問(wèn)題

　　雖然農藥殘留的微生物降解研究已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，而且也有了一些應用的實(shí)例，但研究大多局限在實(shí)驗室中，農藥降解菌完全走出實(shí)驗室到實(shí)際應用中還有一段路要走。農藥微生物降解的問(wèn)題主要有以下幾方面。

　　2.1 單一菌株的純培養問(wèn)題

　　以往的研究主要集中在單一菌株的純培養上，在實(shí)驗室內獲得純培養的菌株，然后研究它的特性、降解機理等。然而這一方法完全不符合實(shí)際情況，自然狀態(tài)下，是多種微生物共存，通過(guò)微生物之間的共同作用把農藥降解。農藥殘留往往存在于土壤、農副產(chǎn)品、廢棄物等復雜環(huán)境中，即使在實(shí)驗室內一株菌的降解活性再大，到了這種復雜條件下可能無(wú)法生存或起不到期望的作用。

　　2.2 環(huán)境條件對微生物降解農藥的影響

　　外部環(huán)境對微生物生長(cháng)和對農藥的降解影響很大，如環(huán)境的溫度、水分含量、pH、氧含量等，而自然環(huán)境中這些因素變化很大，這直接影響到微生物對農藥的降解。如何克服環(huán)境的影響從而充分發(fā)揮目標微生物的作用是需要解決的重大問(wèn)題。

　　2.3 微生物降解目標化合物對降解的影響

　　目標化合物的濃度是否能使微生物生長(cháng)，另外，農藥污染環(huán)境的化合物組分很不穩定，波動(dòng)很大，這給以工程措施微生物降解農藥化合物帶來(lái)困難。

　　2.4 微生物與被降解物接觸的難易程度

　　 被農藥污染的環(huán)境有土壤、空氣、水體及蔬菜瓜果等，對于土壤和水體的污染，微生物很容易與污染物接觸，從而發(fā)揮它們的降解功能。但是，對于被農藥污染的食品來(lái)說(shuō)，利用微生物降解殘留的農藥很難，因為微生物無(wú)法與存在于物體內部的殘留農藥接觸，無(wú)法發(fā)揮它們的作用，而只能降解殘留在物體表面的部分。這種限制需要人們盡快解決，從而擴大微生物降解農藥的應用范圍。

　　2.5 微生物的適應性問(wèn)題

　　所接種的微生物能否適應污染的環(huán)境，這不僅包括上述提到的物理環(huán)境，還涉及到生物之間的關(guān)系。接種到環(huán)境中的微生物受到抑制物的影響，或者受到包括捕食者在內的土著(zhù)微生物的影響，甚至受到拮抗作用而不能生長(cháng)等，這些都可以造成接種的微生物不能成為優(yōu)勢菌從而失去對農藥的降解作用。構建多菌株復合系，具有穩定性和抗污染性強的優(yōu)點(diǎn)，但即使是多菌混合培養的復合系也同樣存在能否成為優(yōu)勢群體的問(wèn)題。

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