顯色培養基在單核細胞增生李斯特菌快速檢測中的應用研究（1）

 [摘要] 目的：研究顯色培養基對單核細胞增生李斯特菌的檢測效果，探討建立新型快速檢測方法。方法：檢測按國標GB4789—33程序進(jìn)行。結果：人工污染樣品和實(shí)際樣品檢測中，顯色培養基CHROMagar Listeria和HKListeria與傳統平板OXA和MMA可以達到相同的檢測限和靈敏度，且具有更高的特異性。結論：用顯色培養基檢測單核細胞增生李斯特菌是一種新途徑，可大大提高檢測效率。

[關(guān)鍵詞] 顯色培養基；單核細胞增生李斯特菌；快速檢測              

單核細胞增生李斯特菌(簡(jiǎn)稱(chēng)“單增李斯特菌”)是一種重要的食源性致病菌，廣泛存在于肉類(lèi)、禽類(lèi)、乳制品等食品中，引起新生兒腦膜炎和成人敗血癥等疾病，是食品微生物的常檢項目之一。美國食品和藥品管理局(FDA)、美國農業(yè)部(USDA)、ISO11092標準、國際分析委員會(huì )(AOAC)和中國國標(GB4789—33)等都建立了各自的檢測方法，所用培養基包括OXA、PAL、MMA、MOX、TSA—YE等，但只適用于李斯特菌的選擇性分離培養，不能特異性分離單增李斯特菌。目前仍需一種選擇性平板可以有效的分離單增李斯特菌。鑒于此，一些顯色培養基如CHROMagar Listeria(法國科瑪嘉)、HKListefia(廣東環(huán)凱)等不斷開(kāi)發(fā)出來(lái)，用于單增李斯特菌的快速檢測中，直接根據菌落顏色和形態(tài)就可對菌種作出鑒定，大大縮短了檢測時(shí)間，提高了檢測效率。本文通過(guò)對人工污染樣品和實(shí)際樣品檢測，比較了CHROMagar Listeria、HKListeria與傳統平板OXA、MMA的檢測效果。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

單增李斯特菌Listeria monocytogenes ATCC94002、大腸桿菌Escherichia coli 8099、沙門(mén)菌Salmonella typhi、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus、蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus、糞鏈球菌Enterococcus faecalis、英諾克李斯特菌L.innocua(簡(jiǎn)稱(chēng)“英諾克”)、威爾李斯特菌L.welshimeri(簡(jiǎn)稱(chēng)“威爾”)分離株由廣東省微生物研究所微生物檢測新技術(shù)發(fā)展中心提供。

1.2 培養基及試劑

HKListeria、CHROMagar Listeria、OXA、MMA、TSA-YE、LB1、LB2李斯特菌增菌液、萘啶酮酸、丫啶黃、李斯特菌生化鑒定管等由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供。

1.3 主要儀器

法國生物梅里埃公司Biomerieux全自動(dòng)微生物鑒定系統，API Listeria生化檢測試劑條。

1.4 樣品

試驗所用樣品豬肉、牛肉、雞肉、魚(yú)肉、熟食、蔬菜、蛋糕等，均采集于附近超市和肉菜市場(chǎng)。

1.5 方法

1.5.1 培養基制備  HKListeria、CHROMagar Listeria、OXA按生產(chǎn)廠(chǎng)家的說(shuō)明書(shū)制備，MMA、TSA-YE按國標GB4789-33法配制。

1.5.2 顯色培養基特異性檢驗   將單增李斯特菌、英諾克、威爾、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌、糞鏈球菌在腦心浸液瓊脂，大腸桿菌、沙門(mén)菌在營(yíng)養瓊脂培養基上培養24 h后，劃線(xiàn)接種HKListeria、CHROMagar Listeia、OXA、MMA培養基，37℃培養24 h，觀(guān)察。

1.5.3 顯色培養基靈敏度檢驗  (1)挑取1環(huán)單增李斯特菌加到10 ml 0.85％ 生理鹽水中配成原液，然后進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)��?/SPAN>10^-4、10^-5、10^-6 菌液各100ul ，分別涂布HKListeria、CHROMagar Listeia、OXA和TSA-YE平板。37℃ 培養36h，計數菌落數。(2)取單增李斯特菌10^-3～10^-8濃度菌液，分別加入2．1×10⁴cfu／ml金黃色葡萄球菌、1.4×10⁴ cfu／ml蠟樣芽孢桿菌、1.6×10⁴ cfu／ml大腸桿菌和1.3×10⁵cfu／ml糞鏈球菌，震蕩混勻，取100分別涂布HKListeria、CHROMagarListeia和OXA平板，以10^-3～10^-8 純菌液涂布TSA-YE做對照，37℃培養36 h，計數單增李斯特菌菌落數，比較在干擾菌株濃度較高而目標菌較低時(shí)各培養基的靈敏度。

1.5.4 人工污染樣品

1.5.4.1 純菌污染樣品檢測：將單增李斯特菌梯度稀釋后，取10-3—10-8“菌液各1 ml，分別加入到10 g豬肉和9 ml牛奶中，均勻混合2 h。按國標GB47893—33方法增菌，劃線(xiàn)接種HKListeria、CHROMagar Listeia、OXA和MMA培養基，37℃ 培養24 h，觀(guān)察單增李斯特菌在各培養基上的檢出情況。

1.5.4.2 單增李斯特菌和非李斯特菌混合污染樣品檢測：將單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌、沙門(mén)菌、糞鏈球菌近似等比例混合后，10倍梯度稀釋成10-3～10-8 不同濃度的混合菌液，各取1 m1分別加入到10 g豬肉和9 ml牛奶中，按國標GB47893—33增菌后，劃線(xiàn)接種HKListeria、CHROMagar Listeia、OXA和MMA培養基，37℃ 培養24 h，觀(guān)察單增李斯特菌在各培養基上的檢出情況。

1.5.4.3 單增李斯特菌、英諾克和非李斯特菌混合污染樣品檢測：由于樣品中李斯特菌數量一般較少，約1—10 cfu／ml，而英諾克是單增李斯特菌的主要競爭菌，其他李斯特菌對單增李斯特菌影響不大，因此將單增李斯特菌和英諾克按100 cfu：10 cfu、10 cfu：10 cfu和10 cfu：100 cfu 3種近似比例混合，然后加入(10⁴ -10⁵ )cfu／ml金黃色葡萄球菌、(10⁴ -10⁵  )cfu／ml蠟樣芽孢桿菌、(10⁴ -10⁵)cfu／ml大腸桿菌、(10⁴ -10⁵  )cfu／ml沙門(mén)菌、(10⁴ -10⁵  )cfu／ml糞鏈球菌，制成混合菌液，分別加入到9 ml牛奶和10 g豬肉中，按國標GB47893— 33法，劃線(xiàn)接種HKListeria、CHROMagar Listeia、OXA和MMA平板，37℃培養24 h，觀(guān)察單增李斯特菌在各培養基上的檢出情況。

1.5.5 實(shí)際樣品 從市場(chǎng)購買(mǎi)實(shí)際樣品共62份，按國標GB4789—33增菌，劃線(xiàn)接種HKListeria、CHROMagar Listeia、OXA和MMA平板，觀(guān)察李斯特菌的檢出情況。

1.6 分離鑒定

將疑似菌落進(jìn)行純化，用法國生物梅里埃公司API Listeria試劑條，并結合傳統生化鑒定方法進(jìn)行鑒定。

2 結果

2.1 顯色培養基的特異性

顯色培養基特異性檢驗結果如表1。HKListeria、CHROMagar Listeia具有較好的特異性，單增李斯特菌呈現藍色帶白色暈環(huán)的菌落，威爾和英諾克李斯特菌呈現藍色無(wú)暈環(huán)菌落；金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌在CHROMagar Listeia上略有生長(cháng)，呈現綠色無(wú)暈環(huán)菌落，菌落形態(tài)與單增李斯特菌也有明顯區別；在上述兩種顯色培養基上大腸桿菌和沙門(mén)菌等革蘭陰性菌均被抑制。與顯色培養基相比，OXA、MMA特異性較差，不能特異區分單增李斯特菌。

表1 不同菌株在各種培養基上的生長(cháng)情況

2．2 顯色培養基靈敏度檢測結果

單增李斯特菌10^-4、10^-5、10^-6 純菌液在各培養基上的生長(cháng)情況如表2。對各培養基上的菌落數進(jìn)行方差分析，P>0.05，表明HKListeria、CHROMagar Listeia、OXA和TSA-YE對單增李斯特菌的檢出率無(wú)顯著(zhù)差異，其靈敏度相當；單增李斯特純菌10^-3-10^-8 菌液混合金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌和糞鏈球菌后，涂布平板的結果如表3。方差分析結果表明，P>0.05，4種培養基的靈敏度相當，當有高數量雜菌存在時(shí)同樣可以達到相同的檢測限。

表2 單增李斯特菌在各個(gè)培養基上的生長(cháng)情況(Mean±Sd)

表3 非李斯特干擾菌存在下各培養基上單增李斯特菌數(Mean±Sd)

TSA—YE上為單增李斯特菌純菌液的涂布結果(對照)

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