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2.3 抗生素的平板抑菌實(shí)驗結果
將萬(wàn)古霉素、頭孢噻吩、紅霉素分別以不同的濃度添加到基礎培養基(腦心瓊脂)中，接種定量菌液，觀(guān)察抑菌效果，以確定最終的抗生素組合和添加濃度。結果表明，萬(wàn)古霉素、頭孢噻吩適合使用于阪崎腸桿菌選擇性培養，與定量抑菌實(shí)驗結果一致；而紅霉素與定量抑菌濃度實(shí)驗結果不一致，不適合使用于阪崎腸桿菌選擇性培養。
將萬(wàn)古霉素(4ug／mL)和頭孢噻吩(0.1ug／mL)兩種抗生素組合添加到基礎培養基中，制備成抗生素選擇培養基，阪崎腸桿菌能生長(cháng)， 10株非阪崎腸桿菌中的9株(大腸桿菌、沙氏菌、志賀氏菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、陰溝腸桿菌、普通變形桿菌、奇異變形桿菌)均被抑制，沒(méi)有生長(cháng)，只有產(chǎn)氣腸桿菌能生長(cháng)。表明在基礎培養基中添加兩種抗生素明顯起到了抑制大部分雜菌的效果，結果見(jiàn)圖1。從網(wǎng)中可看出，萬(wàn)古霉素和頭孢噻吩?xún)烧叩目咕V有交叉、也能互相補充，兩者結合使用于阪崎腸桿菌選擇性培養基中，具有除阪崎腸桿菌外比單一抗生素更廣泛的抑菌譜。
2．4 Vc選擇性顯色培養基對不同細菌的生長(cháng)效果
盡管在基礎培養基中添加了抗生素組合后，抑制了絕大部分雜菌，但不可避免地仍有少量雜菌生長(cháng)。為進(jìn)一步增強培養基的特異性，在培養基中添加了顯色劑(5-溴-4氯-3-吲哚-a-葡萄糖苷，0.1ug／L)，阪崎腸桿菌能分解顯色劑，呈藍綠色，從而與其他雜菌區分開(kāi)。
為驗證V 選擇性顯色培養基(基礎培養基+抗生素組合+顯色劑)是否適合阪崎腸桿菌的生長(cháng)，取不同阪崎腸桿菌濃度的10u L菌液(菌量分別為1000、1O0、10、1cfu／mL)涂布到平板培養24h，四個(gè)接種部位都有菌生長(cháng)，菌落呈藍綠色，說(shuō)明該培養基完全不會(huì )抑制阪崎腸桿菌的生長(cháng)，結果見(jiàn)圖2。同時(shí)，取10uL 非阪崎腸桿菌菌液(菌量約10000cfu／mL)涂布到平板培養24h，除產(chǎn)氣腸桿菌有生長(cháng)外，其他9株非阪崎腸桿菌均未生長(cháng)。產(chǎn)氣腸桿菌雖有生長(cháng)，但菌落呈土黃色，與阪崎腸桿菌菌落容易區分。
2.5 Vc選擇性顯色培養基檢測實(shí)際樣品的檢出限
為測定Vc選擇性顯色培養基對實(shí)際樣品的檢出限，人工定量污染阪崎腸桿菌到奶粉樣品，用Vc選擇性顯色培養基和SN／T 1632．1—2005 中的VRBGA平板進(jìn)行對照檢測。檢測結果表明，VRBGA平板上有雜菌生長(cháng)，而Vc選擇性顯色培養基成功抑制了雜菌，增強了特異性。Vc選擇性顯色培養基檢出限達到1cfu，顯示了良好的靈敏性。
3 討論
最早用于分離阪崎腸桿菌的培養基是美國FDA推薦的VRBGA，該菌在VRBGA 平板上可長(cháng)成兩種菌落，一種是典型的光滑型菌落，容易被接種環(huán)移動(dòng)；另一種是干燥型或黏液狀菌落，但大部分生長(cháng)成黏液狀、周邊有膽汁酸沉淀的紅色菌落。但部分其他腸桿菌科細菌在VRBGA上也能形成紅色菌落，不容易區分。
阪崎腸桿菌都有α-D-葡萄糖苷酶活性，利用這一特點(diǎn)，在基礎培養基中加入5-溴-4氯-3-吲哚-a-葡萄糖苷，可制成顯色選擇培養基 。阪崎腸桿菌在顯色培養基上呈藍綠色菌落，但其他一些細菌在顯色培養基上也能產(chǎn)生顏色，如金黃色葡萄球菌、單增李斯特氏菌、無(wú)害李斯特氏菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌呈藍色或藍紫色，肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種菌落中心呈藍綠色，泛菌屬的菌落與阪崎腸桿菌幾乎不能區分。另?yè)䦂蟮�，傷口埃希氏菌、克氏檸檬酸桿菌在顯色培養基上產(chǎn)生藍綠色菌落，非脫羧勒克氏菌菌落中心呈藍色，可見(jiàn)單靠顯色劑并不能達到區分阪崎腸桿菌和雜菌的目的。
設計選擇性培養基的另一種常用方法是在基礎培養基中添加合適的抑菌劑抑制雜菌生長(cháng)，從而有利于目標菌的分離培養。在設計阪崎腸桿菌培養基時(shí)，Iversen 添加了脫氧膽酸鈉；Oh添加了3號膽鹽；趙貴明 添加了月桂基硫酸鈉。但這些抑菌劑主要是抑制革蘭氏陽(yáng)性菌，對革蘭氏陰性菌效果不大，且不具有特別針對性，所以制備成的培養基抑制雜菌效果并不理想。本研究結合藥敏實(shí)驗及抑菌實(shí)驗，找到合適的抗生素組合(萬(wàn)古霉素+頭孢噻吩)及濃度，既能抑制大部分雜菌，又不影響阪崎腸桿菌生長(cháng)。萬(wàn)古霉素主要是抑制革蘭氏陽(yáng)性菌，頭孢噻
吩是廣譜抗生素，對革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌都有一定效果，但阪崎腸桿菌對其耐藥。因此選擇這兩種抗生素進(jìn)行組合，起到了很好的抑制雜菌作用。但仍然有少數雜菌(如產(chǎn)氣腸桿菌)無(wú)法抑制，因此在培養基中添加顯色劑，進(jìn)一步增強選擇性。
此外，用VRBGA 平板來(lái)分離阪崎腸桿菌，該培養基含有酵母粉、蛋白胨、葡萄糖等成分，營(yíng)養非常豐富，阪崎腸桿菌在該培養基上瘋狂生長(cháng)成片狀，常掩蓋了雜菌的存在，不利于叮疑菌落的分離，易導致下一步鑒定的失敗。而本研究建立的Vc選擇性顯色培養基，營(yíng)養適中，且包含適當濃度的抗生素，能抑制阪崎腸桿菌的過(guò)度生長(cháng)，但不影響其檢出水平，菌落大小適度，菌落形態(tài)規則，菌落之問(wèn)有明顯間隙，便于挑選，見(jiàn)圖3。結合抗生素和顯色劑，制備成阪崎腸桿菌選擇性培養基。經(jīng)模擬樣品檢測，表明該培養基能檢測到1cfu，具有良好的檢測限。本研究建立的培養基可應用于奶粉及相關(guān)產(chǎn)品中阪崎腸桿菌的檢驗。
作者：楊萬(wàn)穎，祝仁發(fā)，李傳禮，賴(lài)心田，楊國武
作者單位：深圳市計量質(zhì)量檢測研究院，廣東深圳518131
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