新型阪崎腸桿菌選擇性分離培養的研制(1)

摘 要：目的：篩選一種新型、特異性高的阪崎腸桿菌選擇性培養基。方法：通過(guò)藥敏實(shí)驗，篩選出對阪崎腸桿菌耐藥而對其他雜菌敏感的抗生素；利用抑菌濃度實(shí)驗、抗生素組合平板實(shí)驗，篩選出最佳的抗生素組合方式及濃度。將抗生素組合與顯色劑添加到基礎培養基中，配制成阪崎腸桿菌的新型選擇培養基。結果：組合抗生素(4ug/mL萬(wàn)古霉素、0.1ug／mL頭孢噻吩)和顯色劑(0.1g／L 5-溴-4氯-3-吲哚-a-葡萄糖苷)添加到腦心培養基中，制成阪崎腸桿菌Vc 選擇性顯色培養基，能最大限度地抑制雜菌生長(cháng)，而對阪崎腸桿菌的生長(cháng)沒(méi)有影響。經(jīng)靈敏性實(shí)驗，對接種的奶粉樣品中的阪崎腸桿菌的檢出限達到1 cfu。結論：制得的新型阪崎腸桿菌選擇性培養基特異性強、靈敏度高，可用于奶粉樣品的分離檢測。

關(guān)鍵詞：阪崎腸桿菌，檢測，培養基

阪崎腸桿菌為革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌，有周生鞭毛，能運動(dòng)。嬰幼兒常因食用了污染阪崎腸桿菌的奶粉而引起感染，臨床表現為腦膜炎、敗血癥、壞死性結腸炎等癥狀，死亡率較高，因此受到食品主管部門(mén)和奶粉生產(chǎn)企業(yè)的高度重視。目前，分離阪崎腸桿菌常用培養基為結晶紫中性紅葡萄糖膽鹽瓊脂(VRBGA)和顯色培養基。但由于其選擇性較差，實(shí)際使用時(shí)分離效果不理想，給檢測工作帶來(lái)極大的困難。本實(shí)驗擬通過(guò)大量的阪崎腸桿菌和非阪崎腸桿菌藥敏實(shí)驗，尋找合適的抑菌劑，添加到基礎培養基中，并結合顯色劑，研制出新的阪崎腸桿菌選擇性分離培養基，可大大地提高培養基的選擇性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗材料

阪崎腸桿菌標準株(45001) 購自中國藥品生物制品檢定所；23株野生株阪崎腸桿菌由本實(shí)驗室在檢測樣品中分離；非阪崎腸桿菌(大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氣腸桿菌、陰溝腸桿菌、普通變形桿菌、奇異變形桿菌共1O株)購自中國藥品生物制品檢定所或由本實(shí)驗室保存；腦心瓊脂購自北京陸橋生物技術(shù)有限公司；藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司；抗生素購自Amresco公司；API20E生化試劑條購自生物梅里埃公司。

1.2 實(shí)驗方法

l.2.1 藥敏實(shí)驗對實(shí)驗菌株進(jìn)行82種抗生素的藥敏實(shí)驗，方法參照WS／T 125—1999《紙片法抗菌藥物敏感實(shí)驗標準》。

l.2.2 抗生素定量抑菌濃度實(shí)驗從營(yíng)養瓊脂上取新鮮菌落，用2倍濃縮肉湯調節細菌濃度到l麥氏單位；在細胞培養板上用無(wú)菌水將適當濃度的抗生素由初始濃度依次稀釋至2^-1、2^-2、2^-3、2^-4、2^-5。各稀釋梯度分別加入與抗生素等體積的2倍濃縮肉湯菌液，相當于將抗生素再次稀釋了一倍，菌液濃度相當于0.5麥氏單位；同時(shí)設置空白對照(2倍濃縮肉湯+無(wú)菌水)和細菌生長(cháng)對照(2倍濃縮肉湯菌液+無(wú)菌水)；37℃培養l8h，用酶標儀在63Onm 處測定菌液0D值。

1.2.3 抗生素平板抑菌實(shí)驗將所篩選出的抗生素以不同的濃度以及不同組合添加到腦心培養基中，制備成抗生素平板，涂布阪崎腸桿菌和非阪崎腸桿菌，觀(guān)察其選擇性。

1.2.4 阪崎腸桿菌選擇性顯色培養基(Vc選擇性顯色培養基)對不同細菌的生長(cháng)效果實(shí)驗將所篩選出的抗生素組合(萬(wàn)古霉素4ug／mL、頭孢噻吩0.lug／mL)添加到腦心瓊脂平板中，同時(shí)添加顯色劑(5-溴-4氯-3-吲哚-a-葡萄糖苷，0.1g/ L)，制備成阪崎腸桿菌Vc選擇性顯色培養基。為評價(jià)其對不同細菌生長(cháng)的作用，取 問(wèn)菌量阪崎腸桿菌芮液及高含量的其他實(shí)驗菌株菌液，滴加到抗生素平板上，37℃ 培養24h，觀(guān)察細菌生長(cháng)情況。

1.2.5 Vc選擇性顯色培養基檢測實(shí)際樣品的檢出限實(shí)驗    取新鮮阪崎腸桿菌菌液，依次10倍稀釋至10^-11，每個(gè)稀釋度同時(shí)做菌落計數。取1Og奶粉樣品(已確認無(wú)阪崎腸桿菌)，加入到90mL無(wú)菌水中，添加1 mL稀釋后的菌液(稀釋度從10^-4～10^-11各一份)，37℃ 培養18h；取lOmL培養液，加入到9Oml EE增菌肉湯中，37℃ 培養18h；接種到Vc 顯色平板及VRBGA平板各1份，37℃培養18h，取可疑菌落進(jìn)行API20E 生化鑒定。

2 結果與分析

2．1 藥敏實(shí)驗結果

本實(shí)驗旨在篩選出對阪崎腸桿菌耐藥而對其他非阪崎腸桿菌敏感的抗生素，以添加到基礎培養基中，來(lái)抑制雜菌生長(cháng)。利用本實(shí)驗室從奶粉中分離得到的23株野生型阪崎腸桿菌菌株，通過(guò)�；瘜�(shí)驗分成7個(gè)生化。生化型的不同反映了菌株之間基因上的差異，而菌株的耐藥性也與基因有關(guān)。因此，本實(shí)驗在7種生化型中各取l株作為代表株，進(jìn)行下一步的藥敏實(shí)驗。

用7種生化型的阪崎腸桿菌對82種抗生索進(jìn)行藥敏紙片實(shí)驗。結果表明，青霉素G、苯唑青霉素、紅霉素、克拉霉素、羅紅霉素、新生霉素、乙酰螺旋霉索、柱晶白霉索、林可霉素、萬(wàn)古霉素、麥迪霉素、氟潔霉素、兩性霉素、制霉菌素、滅滴靈、替考拉寧、氟康唑、依康唑、多粘菌素B、頭孢噻吩等20種抗生素對阪崎腸桿菌不敏感。

選取10株非阪崎腸桿菌進(jìn)行上述20種抗生素的藥敏實(shí)驗，這10株非阪崎腸桿菌具有廣泛的代表性，用之所篩選出的抗生素能對絕大多數雜菌有抑制效果。結果表明，青霉素G、紅霉素、萬(wàn)古霉素、多粘菌素B、利福平、頭孢噻吩6種抗生素對阪崎腸桿菌耐藥，而對部分非阪崎腸桿菌敏感。

2.2 定量抑菌濃度實(shí)驗結果

為了尋找出抑菌劑準確的作用劑量，以應用于選擇性培養基中，選取對阪崎腸桿菌耐藥而對非阪崎腸桿菌敏感的6種抗生素進(jìn)行抑菌濃度實(shí)驗。

結果顯示，萬(wàn)古霉索濃度在4ug／mL時(shí)，對金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特氏菌、志賀氏菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌有明顯的抑菌效果，而對阪崎腸桿茼尤抑制表現，表明可以用于Vc、選擇性顯色培養基。頭孢噻吩對金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、陰溝腸桿菌、普通變形桿菌、奇異變形桿菌都有明顯抑菌效果，但在高濃度(16ug／mL以上)時(shí)，對阪崎腸桿菌也有抑菌效果，提示可選用其低濃度(1ug／mL及以下)用于Vc選擇性顯色培養基。紅霉素在lug／mL時(shí)，顯示對所有非阪崎都有一定的抑菌效果，但抑菌效力不高，提示可加大濃度用于Vc選擇性顯色培養基。利福平、多粘菌素B、青霉素G則即使在高濃度時(shí)也對非阪崎腸桿菌的抑菌效力不明顯。因此選擇萬(wàn)古霉素、頭孢噻吩、紅霉素3種抗生素，以檢測其在培養基中不同的濃度對阪崎腸桿菌與非阪崎腸桿菌的實(shí)際生長(cháng)抑制情況。

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