作者：崔堂兵，劉煜平，郭勇，劉治猛
摘要：對枯草芽孢桿菌BS-06產(chǎn)生抗真菌素的條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳發(fā)酵條件為：培養時(shí)間為48h，裝液量為50mL，初始pH值為8.0，培養基中添加2%麥芽糖、0.2%硝酸鉀和1%吐溫-80。指出枯草芽孢桿菌BS-06產(chǎn)生的抗真菌素具有較廣的抗菌譜，對水稻紋枯病菌、稻瘟病菌、節瓜和冬瓜枯萎病菌、苦瓜枯萎病菌均有較好的抗菌效果，有望開(kāi)發(fā)成生物農藥來(lái)防治農作物病原真菌。
關(guān)鍵詞：枯草芽孢桿菌；農用抗生素；抗真菌素；病原真菌
病原真菌會(huì )引發(fā)多種疾病，特別是植物病原真菌引起的植物病害已經(jīng)位居植物三大類(lèi)病害（真菌病害、細菌病害和病毒病害）之首，如在水稻上發(fā)生的240多種病害中，真菌病害占90%。真菌引起植物的多種病害，不僅影響農作物的產(chǎn)量及經(jīng)濟動(dòng)物的生長(cháng)，而且還造成極大的經(jīng)濟損失。
長(cháng)期以來(lái)，在防治植物真菌病害中，人們大量使用化學(xué)農藥，導致了三大難題：（1）環(huán)境污染，殘毒積累，最終危害人類(lèi)的健康；（2）病原真菌抗藥性直線(xiàn)上升；（3）殺死有益微生物，破壞了植物體內微生物種群的平衡，致使病原真菌成為優(yōu)勢種群，加劇病害的暴發(fā)流行。微生物來(lái)源的抗真菌抗生素作為生物農藥的一個(gè)重要分支，具有高效、易分解、無(wú)殘留、不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)，因而日益受到人們的重視。目前已經(jīng)被廣泛應用于防治植物真菌病害的有井岡霉素、春雷霉素、多抗霉素、農抗120、中生菌素、武夷菌素、新多氧霉素、慶豐霉素等。我們從土壤中分離得到1株產(chǎn)抗真
菌物質(zhì)（抗真菌素）的菌株，經(jīng)鑒定屬枯草芽孢桿菌，命名為BS-06。該菌產(chǎn)生的抗真菌素對農業(yè)上多種致病真菌具有良好的抗性，可望開(kāi)發(fā)成為環(huán)保型的生物農藥。
1 材料與方法
1.1 試驗材料
1.1.1 供試菌株 枯草芽孢桿菌BS-06 菌株由華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院生化實(shí)驗室分離、鑒定和保存，水稻紋枯病菌、稻瘟病菌、水稻紋枯病菌為廣東省農科院水稻研究所保存，節瓜枯萎病菌、冬瓜枯萎病菌和苦瓜枯萎病菌為廣東省農科院蔬菜研究所保存。
1.1.2 培養基
PDA培養基平板：新鮮馬鈴薯去皮后，取200g切成小塊，加1000mL蒸餾水，煮沸30min后用紗布過(guò)濾，得馬鈴薯浸汁；然后加入葡萄糖和瓊脂粉各20g，充分溶解后，于121℃下滅菌后倒平板，每個(gè)直徑9cm的培養皿中倒20mL，冷卻后備用。
種子培養基：取牛肉膏0.8g、酵母粉0.5g、葡萄糖1g，溶于 100mL 蒸餾水中，于121℃ 下滅菌后備用。
發(fā)酵培養基：生長(cháng)曲線(xiàn)和抗真菌素積累曲線(xiàn)實(shí)驗 取1000mL蒸餾水中加入牛肉膏8g、酵母粉5g、葡萄糖5g、NaH2PO4 0.5g、K2HPO4 0.5g、MgSO4·7H2O 0.2g、CaCl2·2H20 0.2g，分裝于250mL三角瓶中，裝液量為50mL，自然 pH 值，于121℃下滅菌后備用。其他實(shí)驗的無(wú)機鹽成分相同，并根據不同實(shí)驗目的添加不同種類(lèi)和不同濃度的碳源、氮源、吐溫-80，除不同 pH 值實(shí)驗外均采用自然pH，除不同裝液量實(shí)驗外裝液量均為50mL。
1.2 試驗方法
1.2.1 生長(cháng)曲線(xiàn)和抗真菌素積累曲線(xiàn)的測定 取斜面菌種 1 環(huán)，接種于種子培養基中，在搖床上于 150r/min、30℃.條件下培養12h，作為種子液。按5%的接種量分別接種到上述液體發(fā)酵培養基中，在搖床上于150r/min、30℃.下培養，每12h 取出3瓶，用分光光度計測定發(fā)酵液 600nm 的 OD 值。將各發(fā)酵液分別置于6000r/min 下離心 15min，取上清液，進(jìn)行抗真菌效果實(shí)驗。
1.2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化試驗# 取斜面菌種1 環(huán)，接種于種子培養基中，在搖床上于150r/min、30℃ 條件下培養12h，作為種子液。將種子分別接種到液體發(fā)酵培養基（無(wú)機鹽成分與生長(cháng)曲線(xiàn)實(shí)驗相同，其他實(shí)驗根據實(shí)驗目的不同添加其他成分）中，在搖床上于150r/min、30℃.下培養48h。取發(fā)酵液于6000r/min 下離心15min，取上清液，進(jìn)行抗真菌效果實(shí)驗。
1.2.3 抗真菌效果實(shí)驗 除了抗菌譜實(shí)驗外，其他實(shí)驗均采用水稻紋枯病病菌。取水稻紋枯病等致病菌1 環(huán)，接入5mL 無(wú)菌水中，振蕩均勻，制成菌懸液。吸取0.1mL 致病菌菌懸液，均勻涂布于 PDA 培養基平板上，然后在平板上打直徑0.5cm 的孔，每個(gè)平板打6個(gè)孔，于孔內加入離心后的發(fā)酵液上清 30uL，置于25℃.培養箱中培養4天，測量抑菌圈直徑（mm），以抑菌圈直徑大小表示抗菌效果。
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