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2 結果與討論
2.1 影響0．intermedium DN2生長(cháng)的關(guān)鍵因素
利用JMP軟件對 Plackett-Burman試驗結果進(jìn)行方差分析。結果表明，影響菌株 DN2生長(cháng)的顯著(zhù)因素 (α=0.05)為：胰蛋白胨(P=0.004)、MgSO4·7H2O(P=0.033)、溫度(P=0.008)、裝液量(P=0.030)和培養時(shí)間(P=0．004)。本次實(shí)驗 pH值取值在最佳的水平范圍內，統計分析并未將此作為顯著(zhù)因子。但 pH值是影響細菌生長(cháng)的重要因素，因此下一步實(shí)驗也將予以考慮。菌株DN2是好氧菌，裝液量和轉速均影響其生長(cháng)。但是本次試驗裝液量和轉速的 P值分別為0.030和0.086，說(shuō)明裝液量對 DN2生長(cháng)的影響比轉速大。而本次試驗選取α在0.05水平上的影響因子，故下一步試驗不考慮轉速。
2．2 響應面優(yōu)化DN2生長(cháng)培養基
在對 Plackett-Burman試驗結果分析的基礎上，采用CCRD設計對影響DN2生長(cháng)的關(guān)鍵內在因素胰蛋白胨、MgSO4·7H2O以及初始pH值進(jìn)行了20組試驗，結果見(jiàn)表 2。
表2 旋轉中心組合設計及其實(shí)驗結果
|
實(shí)驗編號 |
X1(蛋白胨) |
X2(MgSO4.7H2O) |
X3(初始pH值) |
菌體濃度（lg cfu/ml） | |
|
實(shí)測值 |
預測值 | ||||
|
1 |
-1 |
-1 |
-1 |
8.741 |
8.723 |
|
2 |
1 |
-1 |
-1 |
8.858 |
8.831 |
|
3 |
-1 |
1 |
-1 |
8.800 |
8.765 |
|
4 |
1 |
1 |
-1 |
8.720 |
8.724 |
|
5 |
-1 |
-1 |
1 |
8.646 |
8.642 |
|
6 |
- |
-1 |
1 |
8.879 |
8.915 |
|
7 |
-1 |
1 |
1 |
8.582 |
8.609 |
|
8 |
1 |
1 |
1 |
8.715 |
8.734 |
|
9 |
-1.682 |
0 |
0 |
8.678 |
8.696 |
|
10 |
1.682 |
0 |
0 |
8.911 |
8.892 |
|
11 |
0 |
-1.682 |
0 |
8.747 |
8.755 |
|
12 |
0 |
1.682 |
0 |
8.646 |
8.637 |
|
13 |
0 |
0 |
-1.682 |
8.789 |
8.834 |
|
14 |
0 |
0 |
1.682 |
8.821 |
8.775 |
|
15 |
0 |
0 |
0 |
9.123 |
9.126 |
|
16 |
0 |
0 |
0 |
9.102 |
9.126 |
|
17 |
0 |
0 |
0 |
9.144 |
9.126 |
|
18 |
0 |
0 |
0 |
9.155 |
9.126 |
|
19 |
0 |
0 |
0 |
9.107 |
9.126 |
|
20 |
0 |
0 |
0 |
9.123 |
9.126 |
從胰蛋白胨、MgSO4·7H20與pH值交互影響DN2菌體濃度的響應面圖(圖 1)，可直觀(guān)地看出各因子對響應值影響的變化趨勢。
2.3 響應面優(yōu)化DN2生長(cháng)的外部條件
Plackett-Burman試驗結果表明，溫度、裝液量和培養時(shí)間是影響DN2生長(cháng)的關(guān)鍵外在因子。Box—Behnken設計對影響 DN2生長(cháng)的關(guān)鍵外在因素進(jìn)行了17組試驗，結果見(jiàn)表3。利用Design—Expert軟件對表 3試驗數據進(jìn)行二次多項回歸擬合，獲得菌體濃度對溫度、裝液量以及培養時(shí)間的二次多項回歸方程為：（略）
對回歸方程取一階偏導等于 0并整理可得培養條件最優(yōu)化值為：X4=32℃，X =88ml，X =34h。 此時(shí)，最大預測菌體濃度為6．73×10 9cfu／ml。圖2是溫度、裝液量與時(shí)間交互影響 DN2菌體濃度的響應面圖。從圖中可直觀(guān)地看出各因子對響應值影響的變化趨勢。
表3 Box-Behnken設計及其實(shí)驗結果
|
實(shí)驗編號 |
X4(溫度) |
X5(裝液量) |
X6(時(shí)間) |
菌體濃度（lg cfu/ml） | |
|
實(shí)測值 |
預測值 | ||||
|
1 |
-1 |
-1 |
0 |
9.378 |
9.385 |
|
2 |
1 |
-1 |
0 |
9.325 |
9.279 |
|
3 |
-1 |
1 |
0 |
9.166 |
9.212 |
|
4 |
1 |
1 |
0 |
9.219 |
9.212 |
|
5 |
-1 |
0 |
-1 |
9.113 |
9.120 |
|
6 |
1 |
0 |
-1 |
9.113 |
9.173 |
|
7 |
-1 |
0 |
1 |
9.590 |
9.530 |
|
8 |
1 |
0 |
1 |
9.378 |
9.371 |
|
9 |
0 |
-1 |
-1 |
9.537 |
9.524 |
|
10 |
0 |
1 |
-1 |
9.272 |
9.219 |
|
11 |
0 |
-1 |
1 |
9.590 |
9.643 |
|
12 |
0 |
1 |
1 |
9.696 |
9.709 |
|
13 |
0 |
0 |
0 |
9.696 |
9.622 |
|
14 |
0 |
0 |
0 |
9.643 |
9.622 |
|
15 |
0 |
0 |
0 |
9.643 |
9.622 |
|
16 |
0 |
0 |
0 |
9.643 |
9.622 |
|
17 |
0 |
0 |
0 |
9.484 |
9.622 |
2．4 優(yōu)化前后菌株 DN2的生長(cháng)曲線(xiàn)經(jīng)過(guò)上述優(yōu)化后，得到最佳培養基組成為(g／L)：胰蛋白胨 11.34牛肉膏3.00、NaCl 5.00、MgSO4·7H20 3.7l，pH值7.23；最佳外界條件：溫度32℃、轉速12Or／min、裝液量88ml／250ml三角瓶、培養時(shí)間34h。在此優(yōu)化條件的基礎上進(jìn)行5L發(fā)酵罐實(shí)驗，以?xún)?yōu)化前的培養基和培養條件作為對照，每4h測定培養液中的菌體濃度(圖3)。從圖3中可以看出，優(yōu)化后菌株DN2達到最大生長(cháng)量的時(shí)間為36h，與預測值34h基本一致，且比優(yōu)化前的48h縮短約12h；最大活菌數達到6.49×109cfu／ml，比優(yōu)化前的7.35×108cfu／ml提高了一個(gè)數量級，與預測值6.73×109cfu／ml較為接近。
3 結 論
本文通過(guò)Plackett—Burman實(shí)驗篩選出胰蛋白胨、MgSO4·7H20、溫度、裝液量和培養 時(shí)間為影響0．intermedium DN2菌株生長(cháng)的顯著(zhù)因素。在此基礎上，采用響應面法優(yōu)化菌株 DN2的培養條件，得到最佳培養基組成為(g／L)：胰蛋白胨11.34、牛肉膏3.0、NaCl 5.0、MgSO4·7H2O 3.7l，pH值7.23；最佳外界條件為溫度32℃、轉速 120r／min、裝液量 88ml／250ml、培養時(shí)間34h。在此優(yōu)化培養條件的基礎上進(jìn)行 5L發(fā)酵罐驗證試驗。結果表明，菌株 DN2達到最大生長(cháng)量的時(shí)間為36h，比優(yōu)化前縮短了約12h；最大菌體濃度為6.49×109 cfu／ml，比優(yōu)化前的7.35×108cfu／ml提高了一個(gè)數量級，與預測值 6．73×109 cfu／ml較為接近。本研究結果為 0．intermedium DN2的研究與應用打下基礎。
作者：袁勇軍 黃麗金 陸兆新
作者單位：南京農業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院農業(yè)部農畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗室 南京 210095
參考文獻 (略)
上一篇：煙堿降解細菌 Ochrobactrum intermedium DN2生長(cháng)培養基及培養條件的優(yōu)化研究（1）
