煙堿降解細菌 Ochrobactrum intermedium DN2生長(cháng)培養基及培養條件的優(yōu)化研究（1）

摘要 在煙堿生物降解的研究和實(shí)際應用中，需要在較短的時(shí)間內獲得大量 0．intermedium DN2菌體。為了提高菌株DN2的菌體濃度，縮短其培養時(shí)間，本研究采用Plackett-Burman設計對影響O．intermedium DN2生長(cháng)的內在和外在相關(guān)因素進(jìn)行了評價(jià)。結果表明，影響菌株 DN2生長(cháng)的顯著(zhù)因素有胰蛋白胨、MgSO4·7H2O、初始 pH值、溫度、裝液量和培養時(shí)間。在此基礎上，采用響應曲面法分別對該菌生長(cháng)培養基的組成和培養條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳培養基組成為(g／L)：胰蛋白胨11.34、牛肉膏3.00、NaCl 5.00、MgSO4·7H2O 3.71，pH值7.23；最佳培養條件為溫度32℃、轉速120r／rain、裝液量 88ml／250ml三角瓶、培養時(shí)間34h。5L發(fā)酵罐驗證實(shí)驗表明，菌株 DN2達到最大生長(cháng)量的時(shí)間為36h，與預測值34h基本一致，比優(yōu)化前縮短約12h；最大菌體濃度為6.49×10⁹cfu／ml，與預測值6.73×10⁹cfu／ml接近，比優(yōu)化前高近一個(gè)數量級。

關(guān)鍵詞 O．intermedium DN2 培養基組成培養條件 Plackett-Burman設計  響應曲面法

煙堿是普通煙草中的生物堿，俗稱(chēng)尼古丁(nicotine)。煙堿既是成癮物質(zhì)也是有毒物質(zhì)。成人一次攝入40～60mg尼古丁，就可能致命。在煙葉和煙草制品的生產(chǎn)過(guò)程中會(huì )產(chǎn)生大量的固體、液體和氣體廢棄物，其中煙堿的平均含量高達 18g煙堿／kg干重。在歐洲，當每kg煙草廢棄物(干重)中煙堿含量超過(guò)500mg時(shí)，就被歸類(lèi)為“有毒和有害物質(zhì)”。1994年以來(lái)，美國一直把煙堿列在美國排放毒性化學(xué)品目錄(Toxics Release Inventory，TRI)中。據報道，我國每年產(chǎn)生的煙草廢棄物約100萬(wàn)噸。這些廢棄物如果不加處理就投放到環(huán)境中，會(huì )破壞生態(tài)環(huán)境，危害人類(lèi)健康。目前，國外研究者已從環(huán)境中分離了多種煙堿降解菌，而國內在這方面的研究較少。實(shí)踐證明，生物降解法是去除或減少煙草廢棄物中煙堿的有效途徑。

本實(shí)驗室從土壤中分離到一株新的煙堿降解細菌，鑒定為Ochrobactrum intermedium DN2 13,14]。學(xué)者們對0．intermedium的認識較晚，Velasco等在 1998年才首次描述了其特征。目前培養該菌主要是用 LB培養基，但菌株 DN2從斜面培養基接種到普通的牛肉膏蛋白胨培養基中，遲滯期長(cháng)，菌體含量較低。這不僅降低研究效率，也會(huì )使生產(chǎn)成本增加，不利于將來(lái)的大規模應用。為縮短制備種子液的時(shí)間，提高種子液中菌體的濃度，本研究分兩階段分別采用 Plackett—Burman篩選實(shí)驗和響應曲面法(response surface methodology，RSM)對該菌生長(cháng)的培養基及培養條件進(jìn)行優(yōu)化。

Plackett—Burman設計法是基于不完全平衡塊原理，能從眾多變量間快速有效地篩選出最為重要的因素。響應曲面法是綜合實(shí)驗設計和數學(xué)建模，通過(guò)局部實(shí)驗回歸擬合因素與結果間的全局函數關(guān)系，同時(shí)對影響生物產(chǎn)量的各因子水平及其交互作用進(jìn)行優(yōu)化與評價(jià)。與傳統優(yōu)化方法相比，RSM所需的實(shí)驗組數相對較少，可節省人力、物力。該法已經(jīng)廣泛地應用于各類(lèi)培養基以及發(fā)酵條件的優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料                 

1.1.1  供試菌株 0．intermedium DN2，本實(shí)驗室從土

壤中分離得到。

1.1.2 培養基  種子培養基(g／L)：牛肉膏3.0、蛋白胨 10.0、NaCl 5.0，pH值 7.0；斜面培養基：種子培養基添加2.0％瓊脂，斜面-4℃冰箱保存；活菌計數培養基：同斜面培養基；Plackett-Burman實(shí)驗培養基：按照實(shí)驗設計配制；旋轉中心組合設計 (central composite rotable design，CCRD)實(shí)驗培養基：以不加蛋白胨的種子培養基為基礎，按照實(shí)驗設計添加胰蛋白胨和MgSO4·7H20配制不同初始 pH值的培養基；Box-Behnken實(shí)驗培養基：CCRD優(yōu)化后的培養基。

1.2 方法

1.2.1  培養條件和方法  從新鮮斜面上取一環(huán)菌體接入種子培養基，30℃，120r／min搖床培養 48h，制得種子液(菌體濃度為 7.06×10 cfu／ml)。以 1％接種量(v／v)接入各培養基中，其它條件依據不同的試驗要求具體確定。CCRD的培養條件：裝液量為 100ml／250m1三角瓶，30℃，120r／min搖床培養24h。

1.2.2 菌體濃度的測定 平板涂布法 ：將培養液適當稀釋?zhuān)�吸�?SPAN lang=EN-US> lml稀釋液涂布于活菌計數平板上。37％恒溫培養 48h后，進(jìn)行菌落計數。結果以 lg cfu／ml報告菌體濃度。

1.2.3 實(shí)驗設計 (1)Plackett-Burman實(shí)驗設計：依據前期的實(shí)驗結果以及細菌生長(cháng)所需營(yíng)養要素的基本原則和影響細菌生長(cháng)的主要外界條件，選取 15種相關(guān)的內在和外在因素為考察對象。它們的取值范圍分別為：葡萄糖2.O0～5.O0g／L、蔗糖 2.00～5.00g／L、胰蛋白胨2.50～5.O0g／L、蛋白胨 2.50～5.00g／L、酵母膏1.00～2.00g／L、NH4NO3 1.O0～2.00g/L、NaCl 1.O0～3.O0g／L、MgSO4·7H2O 0.50 —1.00g／L、FeSO4·5H2O 0.01～0.03g／L、KH2PO4 1.00～3.00g／L、溫度 30～35℃、轉速120～180r／rain、裝液量50.0～100.0ml、初始 pH值6.0～7.0以及培養時(shí)間10～14h。設 2個(gè)重復，以菌體濃度平均值為響應值。本試驗設計、數據分析及模型建立由JMP軟件(version4.0.5，SAS Institute)輔助完成。實(shí)驗設計方案略。(2)RSM實(shí)驗設計：基于 Plackett-Burman試驗結果，采用 CCRD設計對影響菌株 DN2生長(cháng)的關(guān)鍵內在因素進(jìn)行研究和探索，以獲得影響該菌生長(cháng)的最佳培養基組成及其濃度水平范圍。采用 Box-Behnken設計對影響該菌生長(cháng)的關(guān)鍵外在因素進(jìn)行研究。設 2個(gè)重復，以菌體濃度平均值為響應值。實(shí)驗因素水平及其編碼見(jiàn)表 1。實(shí)驗輔助軟件為 Design Expert(version 6.0.5，Stat-Ease Inc．，Mninneapolis，MN，USA)。

表 1  實(shí)驗因素水平及其編碼表

A:x1=(X1-10)/5; x2=(X2-4)/2; x3=(X3-7.25)/1.25; x4=(X4-31)/6;x5=(X5-60)/40;x6=(X6-20)/4

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