微生物來(lái)源的Xa因子抑制劑F02��2172的研究

【摘要】  利用一種由本中心建立的Xa因子抑制劑高通量體外篩選模型，從大量真菌菌庫及其來(lái)源的代謝產(chǎn)物中篩選到了一株可產(chǎn)生陽(yáng)性活性化合物的菌株F02ZA��2172，該菌株的發(fā)酵液經(jīng)有機溶劑提取、硅膠柱色譜、ODS柱色譜、Sephadex LH��20柱色譜及HPLC制備分離，得到F02��2172A、B和C三個(gè)活性化合物。經(jīng)紫外、質(zhì)譜、核磁等理化數據分析，確定這三個(gè)化合物分別與已知化合物6�瞖pi�瞣phiobolin K、ophiobolin K和ophiobolin G的結構相同，但該類(lèi)化合物對Xa因子的抑制活性至今未見(jiàn)報道。

【關(guān)鍵詞】  微生物 Xa因子抑制劑 二倍半萜

    F02��2172, factor Xa inhibitors from metabolites of microorganisms

     ABSTRACT  A high throughput screening model was established for screening factor Xa inhibitors from thousands of strains of fungi, as a result, a strain, F02ZA��2172 with potent suppression activity was isolated. The culture broth of it was processed by solvent extraction, silica column chromatography, Sephadex LH��20 column chromatography and ODS HPLC preparation to obtain three pure active compounds named F02��2172A, B and C. Their chemical structures were elucidated as the compounds named 6�瞖pi�瞣phiobolin K, ophiobolin K and ophiobolin G by physicochemical properties and spectral data of UV, MS, 1H�睳MR and 13C�睳MR respectively. The compounds are reported as factor Xa inhibitors for the first time.

    KEY WORDS  Microorganisms;  Factor Xa inhibitor;  Sesterterpenes

   血栓的形成是心血管疾病(如心肌梗死、中風(fēng)、深度靜脈血栓、肺栓塞等)重要致病因素，抗血栓治療一直是這類(lèi)疾病搶救措施及預防策略的核心，其中抗凝血是抗血栓治療的重要方法之一，因此，尋找更加安全、高效的抗凝血藥物在臨床治療上具有重要的意義。 Xa因子(factor X activated，factor Xa)是一種絲氨酸蛋白酶，位于血液凝集級聯(lián)的上游，處在連接內源性和外源性激活途徑共同通路的中心位置，Xa因子抑制劑既能阻斷內源性凝血亦能抑制外源性凝血的發(fā)生［1］。Xa因子是凝血酶生成的限速成分，由于在血液凝集級聯(lián)反應過(guò)程中還存在生物信號的放大，估計一個(gè)Xa因子抑制劑分子能抑制138個(gè)凝血酶分子的生理效果， Xa因子抑制劑可能比凝血酶抑制劑更為有效［2］。Xa因子只單純促進(jìn)凝血，沒(méi)有凝血酶抑制劑的副作用，因此，Xa因子抑制劑成為近年來(lái)抗凝血藥物研究的熱點(diǎn)之一，有些藥物已經(jīng)上市［如Organon公司和Sanofi�睸ynthelabo公司共同開(kāi)發(fā)的磺達肝素鈉(fondaparinux sodium，商品名：方達帕魯)于2001年12月在美國獲得FDA批準［3］］或正在開(kāi)發(fā)中［4］。

    本實(shí)驗室建立了一個(gè)快速的高通量篩選方法，從大量土壤真菌代謝產(chǎn)物中篩選Xa因子抑制劑，篩選得到陽(yáng)性菌株F02��2172。本文報道其發(fā)酵、分離、結構鑒定和生物學(xué)活性。

    1  材料與方法

    1.1  篩選用微生物的菌株

    真菌菌株由本中心從云南和新疆采集的土壤中分離得到。

    1.2  試劑及儀器

    Xa因子和底物MCA(Boc�睮le�睪lu�睪ly�睞rg��7�瞐mido��4�瞞ethylcoumarin hydrochloride)購自美國Sigma公司；色譜乙腈購自Merck公司；Victor2多標計數儀(美國PE公司)；中壓層析系統(德國B(niǎo)UCHI公司)；高效液相系統(美國Waters公司515泵和PDA檢測器)；高效液相柱Phenomene C18(20mm×250mm，10μm)；核磁共振儀 500MHz(Inova)；質(zhì)譜儀(Autospec�睻ltima)。

    1.3  Xa因子活性測定方法

    活性測定方法由本中心建立，原理是Xa因子可以水解特定的熒光標記多肽底物，通過(guò)熒光值的變化計算抑制劑對酶的抑制活性。

    活性測定反應在96孔板進(jìn)行，樣品孔中加入0.1mol/L Tris(pH8.0，10mmol/LNaCl，10mmol/L CaCl2)、適量的酶液(Xa因子)和樣品的DMSO溶液；對照孔以DMSO代替樣品溶液；空白管以DMSO代替樣品溶液并以Tris緩沖液代替酶液，在37℃保溫15min，測定熒光F1(Ex355nm/Em460nm)；各孔加入底物，37℃保溫1h，測熒光F2。其中，抑制率大于80%的樣品為陽(yáng)性。

    樣品抑制率(%)=［F2-F1］(對照)-［F2-F1］(樣品)［F2-F1］(對照)-［F2-F1］(空白)×100%

    1.4  真菌F02��2172的培養

    將菌株F02ZA��2172斜面接種于種子培養基(淀粉2%，葡萄糖1%，黃豆餅粉0.2%，麥芽粉0.6%，酵母0.5%，CaCO3 0.2%，MgSO4·7H2O 0.1%，NaCl 0.2%，pH7.0)，27℃，220r/min搖瓶培養3d。按1%接種的量接種到固體培養基(大米97.5%，黃豆餅粉2.5%)27℃培養14d。

    1.5  F02ZA��2172的提取分離

    F02ZA��2172固體培養物2kg，用2000ml乙酸乙酯萃取，減壓蒸去溶劑得到深褐色油狀物3.5g。上述粗提物經(jīng)硅膠柱(2.6cm×50cm)色譜，正己烷�惨宜嵋阴ヌ荻认疵�，每50ml收集一管，合并活性組分，減壓蒸干�；钚晕镔|(zhì)部分用ODS反相中壓柱色譜(Merck ODS C18，40μm，1.6mm×50mm)進(jìn)一步分離純化，然后用制備型HPLC進(jìn)行單組分的制備［流動(dòng)相為CH3CN�睭2O(85∶15，V/V)，流速6ml/min，檢測波長(cháng)240nm］，得到F02��2172A(25.0mg)、B(39.3mg)和C(12.4mg)三個(gè)活性化合物。

    2  結果

    2.1  F02��2172A、B和C的理化性質(zhì)及結構

    F02��2172A  無(wú)色粉末，易溶于甲醇、丙酮，氯仿，UVλmax(MeOH)為241nm。ESI�睲S的測定結果顯示該化合物的分子量為384.3，分子式為C25H38O3，1H和13C�睳MR數據見(jiàn)Tab.1；經(jīng)紫外、質(zhì)譜、核磁等理化數據分析并與文獻［5］對照，確定該化合物為6�瞖pi�瞣phiobolin K，化學(xué)結構見(jiàn)Fig.1。

    F02��2172B  無(wú)色粉末，易溶于甲醇、丙酮，氯仿，UVλmax(MeOH)為239nm。ESI�睲S的測定結果顯示該化合物的分子量為384.3，分子式為C25H38O3，1H和13C�睳MR數據見(jiàn)Tab.1；紫外、質(zhì)譜、核磁等理化數據分析并與文獻［5］對照，確定該化合物為ophiobolin K，化學(xué)結構見(jiàn)Fig.1。

    F02��2172C  無(wú)色粉末，易溶于甲醇、丙酮，氯仿，UVλmax(MeOH)為238nm。ESI�睲S的測定結果顯示該化合物的分子量為384.3，分子式為C25H36O2，1H和13C�睳MR數據見(jiàn)Tab.1；紫外、質(zhì)譜、核磁等理化數據分析并與文獻［6］對照，確定該化合物為ophiobolin G，其化學(xué)結構見(jiàn)Fig.1。

    2.2  F02��2172A、B和C的生物活性

    利用本中心建立的體外篩選模型，測定了6�瞖pi�瞣phiobolin K(F02��2172A)、ophiobolin K(F02��2172B)和ophiobolin G(F02��2172C)三個(gè)化合物對與凝血相關(guān)的幾個(gè)酶的抑制活性，它們對Xa因子的活性在1mmol/L濃度以下，對凝血酶(thrombin)和纖溶酶(fibrinolysin)沒(méi)有抑制活性，IC50分別為27.1、3.39和56.7μg/ml。

    3  討論

    Ophiobolins(蛇孢假單殼素)是一族具有三環(huán)或四環(huán)結構的二倍半萜類(lèi)化合物，具有殺線(xiàn)蟲(chóng)、抗真菌、抗細菌和細胞毒等多種生物活性［7］。Ophiobolin A是該類(lèi)化合物中第一個(gè)被發(fā)現的，它的結構是通過(guò)其溴甲氧化衍生物的x射線(xiàn)單晶衍射得到的［8］，文獻報道該化合物具有抑制鈣活化的環(huán)核苷磷酸二酯酶和誘導L1210細胞凋亡的作用［9］。Ophiobolin K具有殺線(xiàn)蟲(chóng)的作用，而6�瞖pi�瞣phiobolin K沒(méi)有活性［5］。本研究測定了6�瞖pi�瞣phiobolin K(F02��2172A)、ophiobolin K(F02��2172B)和ophiobolin G(F02��2172C)三個(gè)化合物對與凝血相關(guān)的幾個(gè)酶的抑制活性，發(fā)現在1mmol/L濃度下它們對凝血酶和纖溶酶沒(méi)有抑制活性，只特異性的對Xa因子有抑制活性，而且ophiobolin K對Xa因子的抑制活性比6�瞖pi�瞣phiobolin K和ophiobolin G強8～18倍，進(jìn)一步的構效關(guān)系研究需找到或分離更多的同系物，此項工作正在進(jìn)行中。

 

【參考文獻】
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