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【摘要】 目的 分離純化枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis ZY-1)溶栓酶,探討該酶的理化性質(zhì)。 方法 枯草芽孢桿菌培養,利用(NH4)2SO4沉淀、Sephadex G-100 柱層析對該酶發(fā)酵液進(jìn)行分離純化,利用四肽底物Sue-Ala-Ala-Pro-Phe-PNA作為底物,研究酶的理化性質(zhì)。 結果 經(jīng)發(fā)酵并純化后獲得的酶液其比活高達26 400 U/mg,酶反應最適溫度45 ℃,最適pH 8.0,且具有較好的熱穩定性。 結論 枯草芽孢桿菌溶栓酶具有溶血栓作用。
【關(guān)鍵詞】 芽孢桿菌,枯草; 纖溶酶
ABSTRACT: Objective Purification of a fibrinolytic enzyme produced from Bacillus subtilis ZY-1 and investigation of its activity and characterization. Methods A high fibrinolytic enzyme was purified with (NH4)2SO4 fractionation and sephadex G-100 gelfiltration chromatography, and characterization was investigated by check the enzymatic activities in different conditions. Results The specific activity of enzyme was 26 400 U/mg, and its optimal temperature and pH was 45 ℃ and 8.0, respectively. The enzyme had fine thermal heat stability. Conclusion The enzyme had potential commercial value.
KEY WORDS: Bacillus subtilis; plasmin
目前常用治療血栓病的藥品有鏈激酶(SK)、尿激酶(UK)、重組組織纖溶酶原激活劑(t-PA)和尿激酶原(pro-UK)等［1］。但它們在不同程度上存在不足,如SK的抗原性強,不可連續用藥超過(guò)7 d,UK雖然可連續使用半個(gè)月無(wú)抗原性,但體內半衰期僅3~20 min,且長(cháng)期大量用藥有全身性出血的傾向,口服一般無(wú)效［2-4］。1987年日本學(xué)者在傳統發(fā)酵食品納豆中發(fā)現一種由枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的具有強烈纖溶活性的絲氨酸蛋白酶,定名為納豆激酶(nattokinase,NK)［5］,該酶口服可通過(guò)腸道迅速吸收并釋放入血,溶栓效率高,藥效時(shí)間長(cháng),有望開(kāi)發(fā)成新型口服溶栓劑［6-7］。本課題組在豆豉食品中篩選出一株產(chǎn)溶栓酶活性很高的枯草芽孢桿菌,探討其產(chǎn)酶條件、提取工藝等以期提高其溶栓酶活性和產(chǎn)量。筆者報告該酶的分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)。
1 材料與方法
1.1 材料
菌株:依據中國豆豉生產(chǎn)方法,制作豆豉［8］,經(jīng)發(fā)酵實(shí)驗,從中篩選出1株在發(fā)酵產(chǎn)物中產(chǎn)生高纖溶活性蛋白酶的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis ZY-1)作為出發(fā)菌株。試劑:凝膠Sephadex G-100(美國Pharmacia公司);底物Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA(英國NEB公司);牛血清白蛋白、考馬斯亮藍G-250(美國Amresco公司);其他試劑均為國產(chǎn)分析純。LB培養基:1%胰蛋白胨,0.5%酵母粉,1%NaCl。固體LB培養基:1%胰蛋白胨,0.5%酵母粉,1%NaCl,2%瓊脂粉。發(fā)酵培養基:2%大米粉,4%豆粕粉,0.04%CaCl2,0.4%K2HPO4,0.2%KH2PO4,0.07%MgSO4。在發(fā)酵培養基100 mL中接種液體菌種6 mL,37 ℃,搖床轉速為180 r/min,發(fā)酵72 h。
1.2 方法
1.2.1 溶栓酶分離純化
取含溶栓酶的發(fā)酵液,經(jīng)9 000 r/min離心、30%~70%(NH4)2SO4分步沉淀,9 000 r/min再離心,沉淀用0.02 mol/L Tris-HCl (pH 7.2)緩沖液溶解后透析濃縮得粗酶液［9］。Sephadex G-100 柱(上海華美實(shí)驗儀器廠(chǎng))層析分離純化溶栓酶:按常規方法處理的Sephadex G-100裝入層析柱(1.5 cm×45 cm),用0.02 mol/L HCl-Tris (pH 7.2)緩沖液平衡。將已濃縮的粗酶液1 mL加入柱中,以相同緩沖液1 mL/min流速洗脫,以每1 mL/min為一管分部收集,用四肽底物法檢測洗脫液,收集含有活性的組分。
1.2.2 SDS-PAGE分析
制備12%分離膠,5%濃縮膠,上樣量20 μL,30 mA穩流電泳(DYY-11型電泳儀,北京市六一儀器廠(chǎng)),用考馬斯亮藍R250染色［10］。
1.2.3 溶栓酶活性測定
在四肽底物Sue-Ala-Ala-Pro-Phe-PNA溶液中加入豆豉溶栓酶酶液1 μL(稀釋10倍),37 ℃中孵育1 min,測定單位時(shí)間內405 nm處光吸收的變化。酶的活性單位定義為:1 min水解該四肽底物生成1 μmol對硝基苯胺的豆豉溶栓酶量為1 U。
1.2.4 溶栓酶性質(zhì)檢測
利用四肽Sue-Ala-Ala-Pro-Phe-PNA作為底物,研究溫度、pH值、金屬離子、有機溶劑對該酶的影響。
1.2.4.1 熱穩定性
取酶液1 μL和1 mmol/L底物49 μL溶于0.02 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)緩沖液50 μL,在不同溫度(25,35,45,55,65,75,85 ℃)下反應1 min測定酶活性。
1.2.4.2 pH值
取酶液1 μL和1 mmol/L底物49 μL分別溶于不同pH的緩沖液50 μL (pH 4.0,5.0為0.05 mol/L醋酸緩沖液,pH 6.0,7.0,7.5,8.0為0.05 mol/L磷酸緩沖液,pH 9.0,10.0為0.05 mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液,pH 11.0,12.0為0.05 mol/L磷酸氫二鈉-氫氧化鈉緩沖液)于37 ℃反應1 min,測定酶活性。
1.2.4.3 金屬離子
取酶液1 μL和1 mmol/L NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2等溶液10 μL溶于0.02 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)緩沖液40 μL,于37 ℃靜置30 min,分別加入1 mmol/L底物49 μL,于37 ℃反應1 min,測定酶活性。
1.2.4.4 有機溶劑
以甲醇、乙醇、異丙醇3種不同有機溶劑為效應物,測定酶活性。
1.2.5 溶栓酶體外對血凝
奶牛體表采血。取4支裝有血液1 mL的試管分別加入等體積的稀釋倍數不同的酶液，將其放入在37 ℃水浴鍋中保溫10 min后觀(guān)察。
2 結 果
2.1 枯草桿菌溶栓酶的純化
溶栓酶在第2個(gè)洗脫峰(圖1)。純化結果見(jiàn)表1。純化倍數3.41,回收率10.29%。表1 溶栓酶的純化（略）
2.2 溶栓酶的SDS-PAGE
溶栓酶經(jīng)純化步驟后得到純酶,其相對分子質(zhì)量為32 kD(圖2)。
2.3 溶栓酶的理化性質(zhì)
2.3.1 最適溫度
溶栓酶活性最大時(shí)的溫度為45 ℃(圖3)。
2.3.2 熱穩定性
溶栓酶在<45 ℃保持穩定,達99％。55 ℃活性有所喪失(約7％),>65 ℃活性全部喪失。酶液反復在－20 ℃凍融4次,活性仍保持在93%以上。
2.3.3 最適pH
溶栓酶活性最大時(shí)的最適pH為8.0(圖4)。
2.3.4 pH穩定性
酶液中加入1 mmol/L底物49 μL,溶栓酶在pH 7.0~10.0較穩定,酶活性>90％。
2.3.5 金屬離子的影響
Na+,K+,Ca2+,Mg2+,Cu2+,Fe3+對溶栓酶有一定的抑制作用,Mn2+，Ba2+對溶栓酶有較強的抑制作用(酶活性<40％),Al3+,Zn2+可提高溶栓酶的活性(酶活性112％和118％)。
2.3.6 有機溶劑的影響
以甲醇、乙醇、異丙醇3種不同有機溶劑為效應物,研究有機溶劑對溶栓酶活性的影響。當甲醇濃度在10%~15%時(shí),相對酶活性下降達30％。但隨濃度繼續增大,相對酶活性變化趨于平穩。乙醇在濃度<20%時(shí),對酶活性略有激活作用;當濃度為10%時(shí)激活作用達到最大,可使酶活性提高13%;當濃度>20%時(shí),酶的活性反而被抑制。異丙醇對溶栓酶總體表現為激活作用,其在所選擇的有機溶劑中,激活作用最強,尤其在低濃度時(shí)(<5%),使酶活性提高70%,但隨濃度的增大,激活作用漸漸減弱。當濃度>25%時(shí),開(kāi)始抑制酶的活性。
2.3.7 溶栓酶體外對血凝的影響
管1所加酶液濃度最高,試管內的血液仍為均勻的流體體系。管2~4血液不是均勻體系,試管底部均有不溶血塊,其大小依次增大(圖5),說(shuō)明溶栓酶體外對抗凝血的作用隨酶液濃度的增大而增大。
3 討 論
3.1 豆豉溶栓酶是從中國傳統食品中發(fā)現的新型溶栓酶,具有較高的纖溶活性,且安全無(wú)毒,持續時(shí)間長(cháng)，相對分子質(zhì)量小,可通過(guò)消化道直接吸收［4,11］。本研究利用(NH4)2SO4沉淀、Sephadex G-100柱層析對該酶發(fā)酵液進(jìn)行分離純化,酶的得率為10.29,相對較低,主要原因是在純化過(guò)程中操作步驟較多,損失較多,今后將繼續摸索條件,控制純化的工藝條件提高酶得率。
3.2 本研究所得枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的溶栓酶的最適反應溫度和pH為45 ℃和8.0,具有一定的熱穩定性。由于胃中的pH環(huán)境呈酸性,所以本研究開(kāi)發(fā)的溶栓酶不適于口服,應考慮取注射液形式。該酶的米氏常數（Km）、最大反應速度（Vmax）等酶反應動(dòng)力學(xué)常數特征有待進(jìn)一步研究。
3.3 基于非水酶學(xué)的興起,本實(shí)驗以甲醇等3種不同有機溶劑為效應物,研究在不同有機溶劑的不同濃度下,溶栓酶催化活性的變化趨勢。實(shí)驗發(fā)現,甲醇對溶栓酶的效應表現為抑制作用;乙醇在低濃度時(shí)略有激活作用,但在達到一定濃度(>20%)后酶活性反而被抑制,且抑制作用明顯強于甲醇。甲醇和乙醇均屬于親水性有機溶劑,它們對酶的抑制作用可能是由于有機溶劑剝奪了酶周?chē)乃瘜?致使由水分子直接或間接參與形成的氫鍵、疏水鍵及范德華力等受到破壞,從而引起酶構象的劇烈改變而使酶活性下降。而異丙醇對酶的激活效應,可能是由于它們能介入酶分子的內部,改變酶分子所處環(huán)境的介電常數,引起肽鏈伸展,從而改變了酶活性中心必需基團所處的微環(huán)境極性,影響了酶的催化活性。
3.4 本實(shí)驗以牛血為對象,觀(guān)察不同濃度酶液對血凝的影響,隨著(zhù)酶液稀釋倍數的增大,其抗凝血作用減弱,證明從本實(shí)驗枯草芽孢桿菌LD-8547發(fā)酵后所提取的酶液具有溶血栓作用,具有開(kāi)發(fā)應用價(jià)值。
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